Sviluppo della diagnosi prenatale non invasiva per i disturbi di un singolo gene (DANNIgene)

Dall’identificazione del cffDNA nel plasma materno nel 1997, ci sono stati rapidi sviluppi nello sfruttamento della sua presenza per la diagnosi e lo screening prenatale. I primi studi di prova di principio che utilizzavano il cfDNA del plasma materno per rilevare l'aneuploidia fetale sono stati pubblicati nel 2008, a seguito dei quali vi è stata una rapida commercializzazione. Oggigiorno, il test prenatale non invasivo (NIPT) per le aneuploidie è ampiamente utilizzato in tutto il mondo come test di screening per le trisomie fetali più frequenti. A differenza del test prenatale non invasivo, in cui un risultato positivo richiede conferma a seguito di un test invasivo, la diagnosi prenatale non invasiva (NIPD) offre il vantaggio di una diagnosi definitiva senza una procedura invasiva - e il rischio di aborto associato - perché il mosaicismo placentare confinato non si verificano con NIPD per disturbi monogenici (SGD).

Il NIPD può essere offerto prima della gravidanza rispetto ai test invasivi, a partire dalla 7a settimana di gestazione. Ciò può ridurre l’ansia dei genitori e concedere più tempo per il processo decisionale e la pianificazione. In effetti, ci sono sfide sostanziali da superare per l’SGD-NIPD. i/ Il cffDNA circolante, che viene rilasciato dalla placenta a partire dalla quarta settimana di gestazione, costituisce solo il 5%-20% del cfDNA totale circolante nel plasma materno. Questa percentuale aumenta con la gestazione ed è influenzata da fattori quali il peso materno, il fumo e complicazioni della gravidanza come la preeclampsia. Di conseguenza, sono necessarie tecniche ottimizzate e approcci di rilevamento altamente sensibili per rilevare varianti nel DNA fetale. ii/ la frazione fetale deve essere calcolata per confermare che sono presenti livelli sufficienti di cffDNA e per evitare risultati falsi negativi. iii/ Un altro problema è la breve lunghezza del frammento del cffDNA, che rende difficile il rilevamento di triplette ripetute e grandi delezioni o duplicazioni.

Oltre alla determinazione del sesso fetale e allo stato Rhesus D del feto, il team del ricercatore principale è stato il primo a proporre la SGD-NIPD per l'uso nella pratica clinica in Francia per i disturbi autosomici causati da mutazioni de novo o ereditate paternamente, per le quali le varianti nel DNA fetale possono essere facilmente identificate. distinto nell'alto background del cfDNA materno. La reazione a catena della polimerasi digitale a goccia o il sequenziamento di nuova generazione possono essere utilizzati per individuare una singola mutazione per questa analisi.

Tuttavia, questo approccio richiede sviluppi specifici per la mutazione ed è limitato alle mutazioni puntiformi assenti nel DNA materno. La NIPD per le malattie legate all'X, così come per le malattie autosomiche dominanti ereditate dalla madre o autosomiche recessive per le quali entrambi i genitori sono portatori della stessa mutazione, ha rappresentato una sfida maggiore. È necessario un approccio quantitativo per accertare l'eredità fetale della mutazione materna. Nelle malattie autosomiche dominanti con mutazione materna o nelle malattie autosomiche recessive, si prevede che il rapporto tra le copie totali dell'allele mutante (M) e dell'allele selvatico (N) nel plasma materno fornito dal DNA libero materno e fetale sia essere equilibrato (M=N) se il genotipo del feto (M/N) è identico a quello della madre (M/N). Tuttavia, il rapporto allelico sarà sbilanciato se il genotipo fetale è diverso dal genotipo materno. Se il feto ha ereditato entrambi gli alleli selvatici parentali (N/N), ci sarebbe un dosaggio aggiuntivo dell'allele selvatico nel plasma materno fornito dal feto, con conseguente sottorappresentazione delle copie totali dell'allele mutante (M<N ). Al contrario, se il feto ha ereditato gli alleli mutanti parentali (M/M), ci sarebbe un dosaggio aggiuntivo dell'allele mutante nel plasma materno fornito dal feto, con conseguente sovrarappresentazione nelle copie totali dell'allele mutante (M >N). Il grado di squilibrio allelico atteso nel plasma materno dipende dalla frazione di DNA fetale nel plasma materno.

È stato sviluppato un approccio quantitativo relativo al dosaggio della mutazione (RMD) per rilevare tale squilibrio allelico mutante. Questo approccio è stato applicato al rilevamento non invasivo di malattie recessive come la beta-talassemia e l'anemia falciforme, ma anche di malattie legate all'X come l'emofilia. Tuttavia, l'interrogatorio diretto della mutazione sembra essere difficile, se non impossibile, in alcuni loci genomici a causa della presenza di sequenze ripetitive, pseudogeni omologhi e riarrangiamento genomico indefinito. Inoltre, la corretta classificazione dello squilibrio allelico dipende statisticamente dalle copie disponibili di alleli mutanti e selvatici nel campione di sangue, ostacolata dalla concentrazione assoluta molto bassa di cfDNA. Di conseguenza, l'analisi RMD è ancora in una fase di prova di concetto, essendo valutata in un numero limitato di studi, con un numero limitato di pazienti, e non è mai stata implementata nella diagnosi di cura standard, a conoscenza dello sperimentatore.

Queste sfide hanno ispirato una soluzione alternativa con l'inferenza indiretta dello stato mutazionale mediante analisi del dosaggio relativo dell'aplotipo (RHDO). SGD-NIPD mediante inferenza indiretta dello stato mutazionale mediante RHDO ha dimostrato di avere successo per la talassemia ed è ora nella pratica clinica solo nel Servizio sanitario nazionale del Regno Unito per la fibrosi cistica, l'atrofia muscolare spinale e la distrofia muscolare di Duchenne. Sebbene l’RHDO si sia dimostrato affidabile, i controlli di qualità e le soglie decisionali non sono affrontati in modo approfondito per l’implementazione clinica.

Il team del ricercatore principale si è ispirato all'approccio sviluppato da Dennis Lo e ha arricchito l'aspetto metodologico i/ consentendo di controllare in modo completo gli errori statistici; ii/ identificando distintamente i parametri chiave che influenzano la prestazione diagnostica dell'RHDO; iii/ individuando le caratteristiche di output che illustrano la qualità complessiva del test.

Tutti questi fattori sono stati poi uniti, ottenendo punteggi di qualità e definizione di soglie decisionali.

Il team del ricercatore principale ha condotto un lavoro preliminare fruttuoso che ha coinvolto più di 90 famiglie a rischio per 5 disturbi.

Nel complesso, il flusso di lavoro sembra essere:

Specifico: 92/92 (100%) genotipo fetale identificato correttamente, tra test conclusivi (es. 92 risultati concordanti + 0 discordanti) Sensibile: 92/98 (94%) test conclusivi, tra tutti i test (es. 92 risultati concordanti conclusivi + 6 risultati concordanti inconcludenti) Clinicamente fattibile: tempo di risposta di 5-6 giorni lavorativi. Universale: applicabile a qualsiasi profilo mutazionale (mutazione puntiforme, delezione, duplicazione, espansione di triplette ecc.).

Adattabile: può essere facilmente modificato per testare altri SGD. Il presente progetto mira a sfruttare l'esclusiva rete di collaborazione francese per rendere possibile la SGD-NIPD teoricamente per qualsiasi disturbo monogenico e per qualsiasi famiglia. I ricercatori desiderano basarsi su questo lavoro preliminare per ampliare il flusso di lavoro a ciascuna malattia di interesse per una valutazione completa delle prestazioni diagnostiche di SGD-NIPD. Alla fine, questo risultato della collaborazione consentirà di ridisegnare il panorama francese della diagnosi prenatale.

Un vantaggio dell’approccio proposto in questo studio è che è mirato. L'analisi RHDO e il suo risultato saranno specifici del locus del DNA coinvolto nel disturbo familiare e non influenzeranno altre regioni del genoma. Di conseguenza, i ricercatori non dovranno confrontarsi con questioni etiche e sociali relative al sequenziamento completo dell'esoma o del genoma in ambito prenatale, ad esempio i problemi di consulenza che sorgono attraverso l'identificazione di varianti di significato incerto o risultati accidentali.

La SGD-NIPD sarà proposta dai Centri Multidisciplinari per la Diagnosi Prenatale alle donne incinte sottoposte a diagnosi prenatale invasiva in un contesto di storia familiare di disturbi monogenici a causa di mutazioni patogene parentali in uno dei seguenti geni: HBB, CFTR, FMR1, SMN1, DMPK, DMD, NF1, HTT, F8, F9, GCK, L1CAM, PKHD1 o ATP7A.

Le capacità di reclutamento vengono valutate considerando la prevalenza delle malattie rare e le attività di ciascun centro co-investigatore come riportato annualmente nel rapporto dell'agenzia di biomedicina.