Rozwój nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej chorób jednogenowych (DANNIgene)

Od czasu identyfikacji cffDNA w osoczu matki w 1997 r. nastąpił szybki rozwój wykorzystania jego obecności w diagnostyce prenatalnej i badaniach przesiewowych. Pierwsze dowody potwierdzające zasadność badań wykorzystujących cfDNA z osocza matki do wykrywania aneuploidii płodu opublikowano w 2008 r., po czym nastąpiła szybka komercjalizacja. Obecnie nieinwazyjne badania prenatalne (NIPT) w kierunku aneuploidii są powszechnie stosowane na całym świecie jako badanie przesiewowe w kierunku najczęstszych trisomii płodów. W przeciwieństwie do nieinwazyjnych badań prenatalnych, w których pozytywny wynik wymaga potwierdzenia w wyniku testu inwazyjnego, nieinwazyjna diagnostyka prenatalna (NIPD) zapewnia ostateczną diagnozę bez procedury inwazyjnej – i związanego z nią ryzyka poronienia – ponieważ ograniczona mozaikowość łożyska nie powoduje występują w przypadku NIPD w przypadku zaburzeń jednogenowych (SGD).

NIPD można zaproponować już w ciąży niż badania inwazyjne, począwszy od 7. tygodnia ciąży. Może to zmniejszyć niepokój rodziców i dać więcej czasu na podejmowanie decyzji i planowanie. Rzeczywiście, przed SGD-NIPD stoją poważne wyzwania do pokonania. i/ Krążący cffDNA, który jest uwalniany z łożyska od około 4 tygodnia ciąży, stanowi jedynie 5–20% całkowitego krążącego cfDNA w osoczu matki. Odsetek ten zwiększa się wraz z ciążą i wpływają na niego takie czynniki, jak masa ciała matki, palenie tytoniu i powikłania ciąży, takie jak stan przedrzucawkowy. W związku z tym do wykrycia wariantów w płodowym DNA potrzebne są zoptymalizowane techniki i bardzo czułe metody wykrywania. ii/ należy obliczyć frakcję płodową, aby potwierdzić, że obecny jest wystarczający poziom cffDNA i aby uniknąć wyników fałszywie ujemnych. iii/ Innym problemem jest krótka długość fragmentu cffDNA, co utrudnia wykrywanie powtórzeń trypletowych oraz dużych delecji lub duplikacji.

Oprócz określenia płci płodu i statusu płodu Rhesus D, zespół głównego badacza jako pierwszy zaproponował SGD-NIPD do stosowania w praktyce klinicznej we Francji w leczeniu chorób autosomalnych spowodowanych mutacjami de novo lub dziedziczonymi od ojca, w przypadku których można łatwo wykryć warianty w DNA płodu. wyróżnia się wysokim tłem matczynego cfDNA. Do ukierunkowania pojedynczej mutacji w tej analizie można zastosować cyfrową reakcję łańcuchową polimerazy lub sekwencjonowanie nowej generacji.

Jednakże podejście to wymaga opracowania specyficznego dla mutacji i ogranicza się do mutacji punktowych, które są nieobecne w matczynym DNA. Większe wyzwanie stanowi NIPD w przypadku chorób sprzężonych z chromosomem X, a także chorób dziedziczonych autosomalnie dominująco, dziedziczonych po matce lub autosomalnie recesywnie, w przypadku których oboje rodzice są nosicielami tej samej mutacji. Aby ustalić dziedziczenie mutacji u matki, konieczne jest podejście ilościowe. W przypadku chorób autosomalnych dominujących z mutacją u matki lub chorób autosomalnych recesywnych oczekuje się, że stosunek całkowitej liczby kopii zmutowanego allelu (M) do allelu typu dzikiego (N) w osoczu matki, na który składa się bezkomórkowy DNA zarówno matki, jak i płodu, będzie wynosić być zrównoważony (M=N), jeśli genotyp płodu (M/N) jest identyczny z genotypem matki (M/N). Jednakże stosunek alleli będzie niezrównoważony, jeśli genotyp płodu różni się od genotypu matki. Jeżeli płód odziedziczył obydwa rodzicielskie allele typu dzikiego (N/N), w osoczu matki od płodu pojawiłaby się dodatkowa dawka allelu typu dzikiego, co skutkowałoby niedostateczną reprezentacją w całkowitej liczbie kopii zmutowanego allelu (M<N ). I odwrotnie, jeśli płód odziedziczył zmutowane allele rodzicielskie (M/M), w osoczu matki pojawiłaby się dodatkowa dawka zmutowanego allelu pochodzącego od płodu, co skutkowałoby nadreprezentacją w całkowitej liczbie kopii zmutowanego allelu (M >N). Stopień oczekiwanej nierównowagi alleli w osoczu matki zależy od frakcji DNA płodu w osoczu matki.

Opracowano podejście ilościowe względnej dawki mutacji (RMD), aby wykryć taką nierównowagę alleli zmutowanych. Podejście to zastosowano do nieinwazyjnego wykrywania chorób recesywnych, takich jak beta-talasemia i anemia sierpowatokrwinkowa, ale także chorób sprzężonych z chromosomem X, takich jak hemofilia. Niemniej jednak bezpośrednie badanie mutacji wydaje się trudne, a nawet niemożliwe, w niektórych loci genomowych ze względu na obecność powtarzających się sekwencji, homologicznych pseudogenów i niezdefiniowanej rearanżacji genomowej. Co więcej, pomyślna klasyfikacja braku równowagi allelicznej jest statystycznie zależna od dostępnych kopii alleli zmutowanych i typu dzikiego w próbce krwi, co jest utrudnione przez bardzo niskie bezwzględne stężenie cfDNA. W rezultacie analiza RMD wciąż znajduje się w fazie weryfikacji koncepcji, jest oceniana w ograniczonej liczbie badań z udziałem ograniczonej liczby pacjentów i według wiedzy badacza nigdy nie została wdrożona w diagnostyce standardowej opieki.

Wyzwania te zainspirowały alternatywne rozwiązanie polegające na pośrednim wnioskowaniu o statusie mutacji za pomocą analizy względnej dawki haplotypu (RHDO). Wykazano, że SGD-NIPD na podstawie pośredniego wnioskowania o statusie mutacji przez RHDO jest skuteczny w leczeniu -talasemii i jest obecnie stosowany w praktyce klinicznej jedynie w brytyjskiej Narodowej Służbie Zdrowia w leczeniu mukowiscydozy, rdzeniowego zaniku mięśni i dystrofii mięśniowej Duchenne'a. Chociaż udowodniono, że RHDO jest niezawodne, kontrole jakości i progi decyzyjne nie są dokładnie uwzględniane pod kątem wdrożenia klinicznego.

Zespół głównego badacza zainspirował się podejściem opracowanym przez Dennisa Lo i wzbogacił aspekt metodologiczny i/ poprzez kompleksowe umożliwienie kontroli błędów statystycznych; ii/ poprzez wyraźne określenie kluczowych parametrów wpływających na skuteczność diagnozy RHDO; iii/ poprzez wskazanie cech wyjściowych ilustrujących ogólną jakość testu.

Następnie wszystkie te czynniki połączono, uzyskując wyniki jakości i definicję progu decyzyjnego.

Zespół głównego badacza przeprowadził wstępną owocną pracę z udziałem ponad 90 rodzin z grupy ryzyka w przypadku 5 zaburzeń.

W sumie przepływ pracy wygląda następująco:

Specyficzne: 92/92 (100%) genotyp płodu został prawidłowo zidentyfikowany na podstawie testów rozstrzygających (tj. 92 wyniki zgodne + 0 niezgodne) Czułość: 92/98 (94%) testów rozstrzygających spośród wszystkich testów (tj. 92 rozstrzygające, zgodne wyniki + 6 niejednoznacznych, zgodnych wyników) Klinicznie wykonalne: czas realizacji 5-6 dni roboczych. Uniwersalny: ma zastosowanie do dowolnego profilu mutacyjnego (mutacja punktowa, delecja, duplikacja, ekspansja tripletów itp.).

Możliwość dostosowania: można go łatwo zmodyfikować do testowania innych SGD. Celem niniejszego projektu jest wykorzystanie unikalnej francuskiej sieci współpracy, aby umożliwić SGD-NIPD w przypadku teoretycznie każdej choroby monogenowej i każdej rodziny. Badacze chcą wykorzystać te wstępne prace, aby poszerzyć przebieg pracy dla każdej interesującej choroby w celu kompleksowej oceny skuteczności diagnostycznej SGD-NIPD. Ostatecznie to wspólne osiągnięcie umożliwi przedefiniowanie francuskiego krajobrazu diagnostyki prenatalnej.

Zaletą podejścia zaproponowanego w tym badaniu jest to, że jest ono ukierunkowane. Analiza RHDO i jej wynik będą specyficzne dla locus DNA odpowiedzialnego za zaburzenie rodzinne i nie będą miały wpływu na inne regiony genomu. W związku z tym badacze nie będą konfrontowani z kwestiami etycznymi i społecznymi dotyczącymi pełnego sekwencjonowania egzomu lub genomu w warunkach prenatalnych, na przykład kwestiami doradczymi, które pojawiają się w wyniku identyfikacji wariantów o niepewnym znaczeniu lub przypadkowych ustaleń.

SGD-NIPD będzie proponowana przez Wielodyscyplinarne Centra Diagnostyki Prenatalnej kobietom w ciąży poddawanym inwazyjnej diagnostyce prenatalnej w kontekście wywiadu rodzinnego w kierunku chorób jednogenowych z powodu patogenicznych mutacji u rodziców w jednym z następujących genów: HBB, CFTR, FMR1, SMN1, DMPK, DMD, NF1, HTT, F8, F9, GCK, L1CAM, PKHD1 lub ATP7A.

Zdolności rekrutacyjne ocenia się, biorąc pod uwagę częstość występowania rzadkich chorób i działalność każdego ośrodka współbadającego, zgłaszaną corocznie w raporcie agencji biomedycyny.