Utvikling av ikke-invasiv prenatal diagnose for enkeltgenforstyrrelser (DANNIgene)

Siden identifiseringen av cffDNA i mors plasma i 1997, har det vært en rask utvikling i å utnytte dets tilstedeværelse for prenatal diagnose og screening. De første proof of principle-studiene som brukte cfDNA fra mors plasma for å oppdage føtal aneuploidi ble publisert i 2008, hvoretter det skjedde en rask kommersialisering. I dag er ikke-invasiv prenatal testing (NIPT) for aneuploider mye brukt over hele verden som en screeningtest for de hyppigste føtale trisomiene. I motsetning til ikke-invasiv prenatal testing, hvor et positivt resultat krever bekreftelse etter en invasiv test, tilbyr ikke-invasiv prenatal diagnose (NIPD) fordelen med en definitiv diagnose uten en invasiv prosedyre - og den tilhørende abortrisiko - fordi begrenset placentamosaikk ikke forekomme med NIPD for enkelt-gen lidelser (SGD).

NIPD kan tilbys tidligere i svangerskapet enn invasiv testing, fra 7 ukers svangerskap. Dette kan redusere foreldres angst og gir mer tid til beslutninger og planlegging. Det er faktisk betydelige utfordringer å overvinne for SGD-NIPD. i/ Sirkulerende cffDNA, som frigjøres fra placenta fra ca. 4 ukers svangerskap, utgjør bare 5%-20% av totalt sirkulerende cfDNA i mors plasma. Denne prosentandelen øker med svangerskapet og påvirkes av faktorer som mors vekt, røyking og graviditetskomplikasjoner som svangerskapsforgiftning. Følgelig kreves optimaliserte teknikker og svært sensitive deteksjonsmetoder for å oppdage varianter i fosterets DNA. ii/ fosterfraksjon må beregnes for å bekrefte at det er tilstrekkelige nivåer av cffDNA tilstede og for å unngå falske negative resultater. iii/ Et annet problem er den korte fragmentlengden til cffDNA, som gjør deteksjon av triplettrepetisjoner og store slettinger eller dupliseringer utfordrende.

Foruten føtal kjønnsbestemmelse og føtal Rhesus D-status, var hovedforskerteamet det første som foreslo SGD-NIPD for bruk i klinisk praksis i Frankrike for autosomale lidelser forårsaket av de novo eller paternalt arvelige mutasjoner, for hvilke varianter i fosterets DNA lett kan brukes. utmerker seg i den høye bakgrunnen til mors cfDNA. Dråpe-digital polymerasekjedereaksjon eller neste generasjons sekvensering kan brukes til å målrette en enkelt mutasjon for denne analysen.

Imidlertid krever denne tilnærmingen mutasjonsspesifikk utvikling og er begrenset til punktmutasjoner som er fraværende fra mors DNA. NIPD for X-koblede lidelser, samt autosomalt dominante mors arvelige eller autosomale recessive lidelser der begge foreldre er bærere av samme mutasjon har vært en større utfordring. En kvantitativ tilnærming er nødvendig for å fastslå føtal arv av mors mutasjon. Ved autosomalt dominante sykdommer med maternal mutasjon eller autosomale recessive sykdommer forventes forholdet mellom de totale kopiene av mutantallelen (M) og villtypeallelen (N) i mors plasma bidratt av både mors og fostercellefri DNA være balansert (M=N) hvis genotypen til fosteret (M/N) er identisk med mor (M/N). Imidlertid vil allelforholdet være ubalansert hvis fosterets genotyp er forskjellig fra mors genotypen. Hvis fosteret har arvet begge parentale villtypealleler (N/N), vil det være ytterligere doser av villtypeallelen i mors plasma bidratt fra fosteret, noe som resulterer i underrepresentasjon i de totale kopiene av mutantallelen (M<N ). Motsatt, hvis fosteret har arvet de parentale mutante allelene (M/M), vil det være ytterligere dose av mutantallelen i mors plasma bidratt fra fosteret, noe som resulterer i overrepresentasjon i de totale kopiene av mutantallelen (M) >N). Graden av forventet allel ubalanse i mors plasma avhenger av DNA-fosterfraksjonen i mors plasma.

En kvantitativ relativ mutasjonsdosering (RMD) tilnærming er utviklet for å oppdage slik mutant allelisk ubalanse. Denne tilnærmingen har blitt brukt til ikke-invasiv påvisning av recessive lidelser som beta-thalassemi og sigdcelleanemi, men også for X-koblede lidelser som hemofili. Likevel ser direkte avhør av mutasjonen ut til å være vanskelig - til og med umulig - i visse genomiske loki på grunn av tilstedeværelsen av repeterende sekvenser, homologe pseudogener og udefinert genomisk omorganisering. Dessuten er vellykket klassifisering av allel ubalanse statistisk avhengig av tilgjengelige kopier av mutante og villtype alleler i blodprøven, hemmet av den svært lave absolutte konsentrasjonen av cfDNA. Som et resultat er RMD-analyse fortsatt i en proof-of-concept-fase, og blir evaluert i et begrenset antall studier, med et begrenset antall pasienter, og har aldri blitt implementert i standardbehandlingsdiagnose til etterforskerens kunnskap.

Disse utfordringene har inspirert en alternativ løsning med indirekte mutasjonsstatusinferens ved relativ haplotypedoseanalyse (RHDO). SGD-NIPD ved indirekte mutasjonsstatusinferens av RHDO har vist seg å være vellykket for -thalassemi og er nå i klinisk praksis bare i Storbritannias nasjonale helsetjeneste for cystisk fibrose, spinal muskelatrofi og Duchenne muskeldystrofi. Selv om RHDO har vist seg å være pålitelig, er kvalitetskontroller og beslutningsgrenser ikke grundig adressert for klinisk implementering.

Hovedetterforskerens team ble inspirert av tilnærmingen utviklet av Dennis Lo og beriket det metodiske aspektet i/ ved å tillate å kontrollere de statistiske feilene omfattende; ii/ ved å tydelig identifisere nøkkelparametere som påvirker diagnoseytelsen til RHDO; iii/ ved å finne utdatafunksjoner som illustrerer den generelle kvaliteten på testen.

Alle disse faktorene ble deretter slått sammen, noe som resulterte i kvalitetspoeng og definisjon av beslutningsterskel.

Et foreløpig fruktbart arbeid som involverte mer enn 90 risikofamilier for 5 lidelser ble utført av hovedetterforskerens team.

Til sammen ser arbeidsflyten ut til å være:

Spesifikt: 92/92 (100 %) føtal genotype korrekt identifisert, blant konkluderende tester (dvs. 92 konkordante + 0 diskordante resultater) Sensitive: 92/98 (94%) konklusive tester, blant alle tester (dvs. 92 konklusivt samsvarende resultater + 6 usikre konkordante resultater) Klinisk levedyktig: behandlingstid på 5-6 virkedager. Universell: gjelder for enhver mutasjonsprofil (punktmutasjon, sletting, duplisering, triplettutvidelse osv.).

Tilpassbar: kan enkelt modifiseres for testing av andre SGD-er. Dette prosjektet tar sikte på å dra nytte av det unike franske samarbeidsnettverket for å gjøre SGD-NIPD mulig for teoretisk enhver monogen lidelse og enhver familie. Etterforskerne ønsker å bygge videre på dette foreløpige arbeidet for å utvide arbeidsflyten til hver sykdom av interesse for en omfattende evaluering av den diagnostiske ytelsen til SGD-NIPD. Til slutt vil denne samarbeidsprestasjonen tillate en omtegning av det franske landskapet for prenatal diagnose.

En fordel med tilnærmingen foreslått i denne studien er at den er målrettet. RHDO-analysen og dens resultat vil være spesifikke for DNA-lokus involvert i familielidelsen, og vil ikke påvirke andre regioner av genomet. Etterforskere vil fortløpende ikke bli konfrontert med etiske og sosiale spørsmål rundt full eksom- eller genomsekvensering i prenatal setting, for eksempel rådgivningsspørsmål som oppstår gjennom identifisering av varianter av usikker betydning eller tilfeldige funn.

SGD-NIPD vil bli foreslått av multidisiplinære sentre for prenatal diagnose til gravide kvinner som gjennomgår invasiv prenatal diagnose i en sammenheng med familiehistorie med enkeltgenforstyrrelser på grunn av foreldrenes patogene mutasjoner i ett av følgende gen: HBB, CFTR, FMR1, SMN1, DMPK, DMD, NF1, HTT, F8, F9, GCK, L1CAM, PKHD1 eller ATP7A.

Rekrutteringskapasiteten vurderes ved å vurdere forekomsten av sjeldne sykdommer og aktivitetene til hvert medetterforskersenter som rapporteres årlig i rapporten fra biomedisinsk byrå.