Ontwikkeling van niet-invasieve prenatale diagnose voor aandoeningen van één gen (DANNIgene)

Sinds de identificatie van cffDNA in maternaal plasma in 1997 zijn er snelle ontwikkelingen geweest in het benutten van de aanwezigheid ervan voor prenatale diagnose en screening. Het eerste proof-of-principle-onderzoek waarbij cfDNA uit maternale plasma werd gebruikt om foetale aneuploïdie te detecteren, werd in 2008 gepubliceerd, waarna er een snelle commercialisering plaatsvond. Tegenwoordig wordt niet-invasieve prenatale testen (NIPT) voor aneuploïdie over de hele wereld op grote schaal gebruikt als screeningstest voor de meest voorkomende foetale trisomieën. In tegenstelling tot niet-invasieve prenatale tests, waarbij een positief resultaat bevestiging vereist na een invasieve test, biedt niet-invasieve prenatale diagnostiek (NIPD) het voordeel van een definitieve diagnose zonder invasieve procedure - en het daarmee samenhangende risico op een miskraam - omdat opgesloten placenta-mozaïcisme niet voorkomt. komen voor bij NIPD voor enkelvoudige genaandoeningen (SGD).

NIPD kan eerder in de zwangerschap worden aangeboden dan invasieve testen, vanaf 7 weken zwangerschap. Dit kan de angst bij ouders verminderen en geeft meer tijd voor besluitvorming en planning. Er zijn inderdaad aanzienlijke uitdagingen te overwinnen voor SGD-NIPD. i/ Circulerend cffDNA, dat vanaf ongeveer vier weken zwangerschap uit de placenta wordt vrijgegeven, maakt slechts 5%-20% uit van het totale circulerende cfDNA in het maternale plasma. Dit percentage neemt toe met de zwangerschap en wordt beïnvloed door factoren zoals het gewicht van de moeder, roken en zwangerschapscomplicaties zoals pre-eclampsie. Bijgevolg zijn geoptimaliseerde technieken en zeer gevoelige detectiebenaderingen nodig om varianten in het foetale DNA te detecteren. ii/foetale fractie moet worden berekend om te bevestigen dat er voldoende cffDNA-niveaus aanwezig zijn en om vals-negatieve resultaten te voorkomen. iii/ Een ander probleem is de korte fragmentlengte van cffDNA, waardoor de detectie van tripletherhalingen en grote deleties of duplicaties een uitdaging is.

Naast foetale geslachtsbepaling en foetale Rhesus D-status was het team van de hoofdonderzoeker het eerste dat SGD-NIPD voorstelde voor gebruik in de klinische praktijk in Frankrijk voor autosomale aandoeningen veroorzaakt door de novo of vaderlijk overgeërfde mutaties, waarvoor varianten in het foetale DNA gemakkelijk kunnen worden vastgesteld. onderscheiden zich door de hoge achtergrond van maternale cfDNA. Druppel-digitale polymerasekettingreactie of Next-Generation Sequencing kunnen worden gebruikt om één enkele mutatie voor deze analyse te targeten.

Deze aanpak vereist echter mutatiespecifieke ontwikkelingen en beperkt zich tot puntmutaties die afwezig zijn in het DNA van de moeder. NIPD voor X-gebonden aandoeningen, evenals autosomaal dominante maternale erfelijke of autosomaal recessieve aandoeningen waarbij beide ouders drager zijn van dezelfde mutatie, vormt een grotere uitdaging. Een kwantitatieve benadering is nodig om de foetale overerving van de maternale mutatie vast te stellen. Bij autosomaal dominante ziekten met maternale mutatie of autosomaal recessieve ziekten wordt verwacht dat de verhouding tussen het totaal aantal kopieën van het mutante allel (M) en het wildtype allel (N) in het plasma van de moeder, bijgedragen door zowel het celvrije DNA van de moeder als dat van de foetus, in evenwicht zijn (M=N) als het genotype van de foetus (M/N) identiek is aan dat van de moeder (M/N). De allelverhouding zal echter uit balans zijn als het foetale genotype verschilt van het moederlijke genotype. Als de foetus beide ouderlijke wildtype allelen (N/N) heeft geërfd, zou er een aanvullende dosering van het wildtype allel in het maternale plasma zijn, bijgedragen door de foetus, resulterend in ondervertegenwoordiging in het totale aantal kopieën van het mutante allel (M<N ). Omgekeerd, als de foetus de ouderlijke mutante allelen (M/M) heeft geërfd, zou er een extra dosering van het mutante allel in het plasma van de moeder zijn, afkomstig van de foetus, wat resulteert in oververtegenwoordiging in het totale aantal kopieën van het mutante allel (M). >N). De mate van verwachte allelische onevenwichtigheid in maternale plasma hangt af van de foetale DNA-fractie in het maternale plasma.

Er is een kwantitatieve relatieve mutatiedosering (RMD)-benadering ontwikkeld om een ​​dergelijke mutante allelische onbalans te detecteren. Deze aanpak is toegepast op de niet-invasieve detectie van recessieve aandoeningen zoals bèta-thalassemie en sikkelcelanemie, maar ook op X-gebonden aandoeningen zoals hemofilie. Niettemin lijkt directe ondervraging van de mutatie op bepaalde genomische loci moeilijk - zelfs onmogelijk - te zijn vanwege de aanwezigheid van repetitieve sequenties, homologe pseudogenen en ongedefinieerde genomische herschikking. Bovendien is de succesvolle classificatie van allelische onbalans statistisch afhankelijk van de beschikbare kopieën van mutante en wildtype allelen in het bloedmonster, gehinderd door de zeer lage absolute concentratie cfDNA. Als gevolg hiervan bevindt de RMD-analyse zich nog steeds in een proof-of-concept-fase, wordt deze geëvalueerd in een beperkt aantal onderzoeken, met een beperkt aantal patiënten, en is deze voor zover de onderzoeker weet nooit geïmplementeerd in de standaardzorgdiagnostiek.

Deze uitdagingen hebben een alternatieve oplossing geïnspireerd met indirecte mutatiestatus-inferentie door relatieve haplotype-doseringsanalyse (RHDO). Er is aangetoond dat SGD-NIPD door middel van indirecte mutatiestatus-inferentie door RHDO succesvol is voor thalassemie en wordt nu alleen in de klinische praktijk toegepast in de National Health Service van het Verenigd Koninkrijk voor cystische fibrose, spinale musculaire atrofie en Duchenne-spierdystrofie. Hoewel RHDO betrouwbaar is gebleken, worden kwaliteitscontroles en beslissingsdrempels niet grondig aangepakt voor klinische implementatie.

Het team van de hoofdonderzoeker raakte geïnspireerd door de aanpak ontwikkeld door Dennis Lo en verrijkte het methodologische aspect door de statistische fouten volledig te kunnen beheersen; ii/ door het duidelijk identificeren van sleutelparameters die de diagnoseprestaties van RHDO beïnvloeden; iii/ door outputkenmerken aan te wijzen die de algehele kwaliteit van de test illustreren.

Al deze factoren werden vervolgens samengevoegd, wat resulteerde in kwaliteitsscores en de definitie van de beslissingsdrempel.

Het team van de hoofdonderzoeker heeft een vruchtbaar voorbereidend werk uitgevoerd waarbij meer dan 90 families betrokken waren die risico liepen op vijf aandoeningen.

Alles bij elkaar lijkt de workflow als volgt te zijn:

Specifiek: 92/92 (100%) foetaal genotype correct geïdentificeerd, onder sluitende tests (d.w.z. 92 concordante + 0 discordante resultaten) Gevoelig: 92/98 (94%) overtuigende tests, van alle tests (d.w.z. 92 overtuigende concordante resultaten + 6 niet-conclusieve concordante resultaten) Klinisch haalbaar: doorlooptijd van 5-6 werkdagen. Universeel: toepasbaar op elk mutatieprofiel (puntmutatie, deletie, duplicatie, tripletexpansie etc.).

Aanpasbaar: kan eenvoudig worden aangepast voor het testen van andere SGD's. Het huidige project heeft tot doel voordeel te halen uit het unieke Franse samenwerkingsnetwerk om SGD-NIPD mogelijk te maken voor theoretisch elke monogene aandoening en elke familie. De onderzoekers willen voortbouwen op dit voorbereidende werk om de workflow uit te breiden naar elke ziekte waarin men geïnteresseerd is, voor een uitgebreide evaluatie van de diagnostische prestaties van SGD-NIPD. Uiteindelijk zal deze gezamenlijke prestatie een hertekening van het Franse landschap van prenatale diagnostiek mogelijk maken.

Een voordeel van de in dit onderzoek voorgestelde aanpak is dat deze doelgericht is. De RHDO-analyse en het resultaat ervan zullen specifiek zijn voor de DNA-locus die betrokken is bij de familiestoornis, en zullen geen invloed hebben op andere delen van het genoom. Bijgevolg zullen onderzoekers niet worden geconfronteerd met ethische en sociale kwesties rond volledige exoom- of genoomsequencing in de prenatale setting, bijvoorbeeld de counselingproblemen die ontstaan ​​door de identificatie van varianten van onzekere betekenis of nevenbevindingen.

SGD-NIPD zal door Multidisciplinaire Centra voor Prenatale Diagnose worden voorgesteld aan zwangere vrouwen die een invasieve prenatale diagnose ondergaan in een context van familiegeschiedenis van aandoeningen met één gen vanwege pathogene mutaties van de ouders in een van de volgende genen: HBB, CFTR, FMR1, SMN1, DMPK, DMD, NF1, HTT, F8, F9, GCK, L1CAM, PKHD1 of ATP7A.

De rekruteringscapaciteiten worden beoordeeld door rekening te houden met de prevalentie van zeldzame ziekten en de activiteiten van elk co-onderzoekscentrum, zoals jaarlijks gerapporteerd in het rapport van het biomedisch agentschap.