Entwicklung einer nicht-invasiven pränatalen Diagnose für Störungen einzelner Gene (DANNIgene)

Seit der Identifizierung von cffDNA im mütterlichen Plasma im Jahr 1997 gab es rasante Fortschritte bei der Nutzung ihres Vorkommens für die pränatale Diagnose und das Screening. Die ersten Proof-of-Principal-Studien mit cfDNA aus mütterlichem Plasma zum Nachweis fetaler Aneuploidie wurden 2008 veröffentlicht, woraufhin eine rasche Kommerzialisierung erfolgte. Heutzutage wird der nicht-invasive pränatale Test (NIPT) auf Aneuploidien weltweit häufig als Screening-Test für die häufigsten fetalen Trisomien eingesetzt. Im Gegensatz zu nicht-invasiven Pränataltests, bei denen ein positives Ergebnis nach einem invasiven Test bestätigt werden muss, bietet die nicht-invasive Pränataldiagnostik (NIPD) den Vorteil einer endgültigen Diagnose ohne invasiven Eingriff – und das damit verbundene Fehlgeburtsrisiko –, da dies bei einem begrenzten Plazentamosaik nicht der Fall ist treten bei NIPD bei Single-Gene Disorders (SGD) auf.

NIPD kann früher in der Schwangerschaft als invasive Tests angeboten werden, und zwar ab der 7. Schwangerschaftswoche. Dies kann die Ängste der Eltern verringern und mehr Zeit für Entscheidungsfindung und Planung lassen. Tatsächlich gibt es für SGD-NIPD erhebliche Herausforderungen zu bewältigen. i/ Zirkulierende cffDNA, die etwa ab der vierten Schwangerschaftswoche aus der Plazenta freigesetzt wird, macht nur 5–20 % der gesamten zirkulierenden cfDNA im mütterlichen Plasma aus. Dieser Prozentsatz steigt mit der Schwangerschaft und wird durch Faktoren wie das Gewicht der Mutter, Rauchen und Schwangerschaftskomplikationen wie Präeklampsie beeinflusst. Daher sind optimierte Techniken und hochempfindliche Nachweisansätze erforderlich, um Varianten in der fetalen DNA zu erkennen. ii/ Die fetale Fraktion muss berechnet werden, um zu bestätigen, dass ausreichende Mengen an cffDNA vorhanden sind, und um falsch negative Ergebnisse zu vermeiden. iii/ Ein weiteres Problem ist die kurze Fragmentlänge der cffDNA, die den Nachweis von Triplett-Wiederholungen und großen Deletionen oder Duplikationen schwierig macht.

Neben der Bestimmung des fetalen Geschlechts und des fetalen Rhesus-D-Status war das Team des Hauptforschers das erste, das SGD-NIPD für den Einsatz in der klinischen Praxis in Frankreich bei autosomalen Störungen vorschlug, die durch de novo oder väterlich vererbte Mutationen verursacht wurden, bei denen leicht Varianten in der fetalen DNA auftreten können zeichnet sich durch den hohen Hintergrund der mütterlichen cfDNA aus. Tröpfchendigitale Polymerasekettenreaktion oder Next-Generation-Sequenzierung können verwendet werden, um eine einzelne Mutation für diese Analyse gezielt auszuwählen.

Allerdings erfordert dieser Ansatz mutationsspezifische Entwicklungen und ist auf Punktmutationen beschränkt, die in der mütterlichen DNA fehlen. NIPD bei X-chromosomalen Erkrankungen sowie autosomal-dominant vererbten oder autosomal-rezessiv vererbten Erkrankungen, bei denen beide Elternteile Träger derselben Mutation sind, stellt eine größere Herausforderung dar. Um die fetale Vererbung der mütterlichen Mutation festzustellen, ist ein quantitativer Ansatz erforderlich. Bei autosomal-dominanten Erkrankungen mit mütterlicher Mutation oder autosomal-rezessiven Erkrankungen ist zu erwarten, dass sich das Verhältnis zwischen den Gesamtkopien des mutierten Allels (M) und des Wildtyp-Allels (N) im mütterlichen Plasma, das sowohl von der mütterlichen als auch der fötalen zellfreien DNA stammt, ändert ausgeglichen sein (M=N), wenn der Genotyp des Fötus (M/N) mit dem der Mutter (M/N) identisch ist. Das Allelverhältnis ist jedoch unausgewogen, wenn sich der fetale Genotyp vom mütterlichen Genotyp unterscheidet. Wenn der Fötus beide elterlichen Wildtyp-Allele (N/N) geerbt hat, würde es im mütterlichen Plasma, das vom Fötus stammt, zu einer zusätzlichen Dosierung des Wildtyp-Allels kommen, was zu einer Unterrepräsentation in den Gesamtkopien des mutierten Allels (M<N) führen würde ). Wenn der Fötus umgekehrt die elterlichen mutierten Allele (M/M) geerbt hat, würde es im mütterlichen Plasma, das vom Fötus stammt, zu einer zusätzlichen Dosierung des mutierten Allels kommen, was zu einer Überrepräsentation in den Gesamtkopien des mutierten Allels (M >N). Der Grad des erwarteten allelischen Ungleichgewichts im mütterlichen Plasma hängt von der fetalen DNA-Fraktion im mütterlichen Plasma ab.

Um ein solches mutiertes Allelungleichgewicht zu erkennen, wurde ein quantitativer relativer Mutationsdosierungsansatz (RMD) entwickelt. Dieser Ansatz wurde für die nicht-invasive Erkennung rezessiver Erkrankungen wie Beta-Thalassämie und Sichelzellenanämie, aber auch für X-chromosomale Erkrankungen wie Hämophilie angewendet. Dennoch scheint die direkte Abfrage der Mutation an bestimmten Genorten aufgrund des Vorhandenseins repetitiver Sequenzen, homologer Pseudogene und undefinierter genomischer Umlagerungen schwierig – sogar unmöglich – zu sein. Darüber hinaus hängt die erfolgreiche Klassifizierung des Allelungleichgewichts statistisch von den verfügbaren Kopien mutierter und Wildtyp-Allele in der Blutprobe ab, was durch die sehr niedrige absolute Konzentration der cfDNA erschwert wird. Daher befindet sich die RMD-Analyse immer noch in der Proof-of-Concept-Phase, wird in einer begrenzten Anzahl von Studien mit einer begrenzten Anzahl von Patienten evaluiert und wurde nach Kenntnis des Prüfarztes nie in die Standarddiagnose integriert.

Diese Herausforderungen haben eine alternative Lösung mit indirekter Mutationsstatusinferenz durch relative Haplotyp-Dosierungsanalyse (RHDO) inspiriert. SGD-NIPD durch indirekte Mutationsstatusinferenz durch RHDO hat sich bei -Thalassämie als erfolgreich erwiesen und wird derzeit nur im britischen National Health Service für Mukoviszidose, spinale Muskelatrophie und Duchenne-Muskeldystrophie in der klinischen Praxis eingesetzt. Obwohl sich RHDO als zuverlässig erwiesen hat, werden Qualitätskontrollen und Entscheidungsschwellen für die klinische Umsetzung nicht umfassend berücksichtigt.

Das Team des Hauptforschers ließ sich von dem von Dennis Lo entwickelten Ansatz inspirieren und bereicherte den methodischen Aspekt, indem es eine umfassende Kontrolle der statistischen Fehler ermöglichte; ii/ durch eindeutige Identifizierung von Schlüsselparametern, die die Diagnoseleistung von RHDO beeinflussen; iii/ durch die Ermittlung von Ausgabemerkmalen, die die Gesamtqualität des Tests veranschaulichen.

Alle diese Faktoren wurden dann zusammengeführt, was zu Qualitätsbewertungen und der Definition von Entscheidungsschwellen führte.

Das Team des Hauptermittlers führte eine vorläufige, fruchtbare Arbeit durch, an der mehr als 90 gefährdete Familien für fünf Erkrankungen beteiligt waren.

Insgesamt scheint der Arbeitsablauf wie folgt zu sein:

Spezifisch: 92/92 (100 %) des fetalen Genotyps wurden in aussagekräftigen Tests korrekt identifiziert (d. h. 92 übereinstimmende + 0 nicht übereinstimmende Ergebnisse) Sensitiv: 92/98 (94 %) schlüssige Tests unter allen Tests (d. h. 92 schlüssige konkordante Ergebnisse + 6 nicht schlüssige konkordante Ergebnisse) Klinisch machbar: Bearbeitungszeit von 5–6 Arbeitstagen. Universell: anwendbar auf jedes Mutationsprofil (Punktmutation, Deletion, Duplikation, Triplett-Erweiterung usw.).

Anpassbar: Kann zum Testen anderer SGDs leicht geändert werden. Das vorliegende Projekt zielt darauf ab, das einzigartige französische Kooperationsnetzwerk zu nutzen, um SGD-NIPD theoretisch für jede monogene Störung und jede Familie zu ermöglichen. Die Forscher möchten auf dieser Vorarbeit aufbauen, um den Arbeitsablauf auf jede interessierende Krankheit auszuweiten, um eine umfassende Bewertung der diagnostischen Leistung von SGD-NIPD zu erhalten. Letztendlich wird diese gemeinsame Leistung eine Neugestaltung der französischen Landschaft der Pränataldiagnostik ermöglichen.

Ein Vorteil des in dieser Studie vorgeschlagenen Ansatzes besteht darin, dass er zielgerichtet ist. Die RHDO-Analyse und ihr Ergebnis sind spezifisch für den DNA-Locus, der an der Familienstörung beteiligt ist, und haben keinen Einfluss auf andere Regionen des Genoms. Infolgedessen werden Forscher nicht mit ethischen und sozialen Fragen im Zusammenhang mit der vollständigen Exom- oder Genomsequenzierung im pränatalen Umfeld konfrontiert, beispielsweise mit Beratungsproblemen, die sich aus der Identifizierung von Varianten mit ungewisser Bedeutung oder Zufallsbefunden ergeben.

SGD-NIPD wird von multidisziplinären Zentren für Pränataldiagnostik schwangeren Frauen vorgeschlagen, die sich einer invasiven Pränataldiagnostik im Zusammenhang mit Familienanamnesen von Einzelgenstörungen aufgrund einer elterlichen pathogenen Mutation in einem der folgenden Gene unterziehen: HBB, CFTR, FMR1, SMN1, DMPK, DMD, NF1, HTT, F8, F9, GCK, L1CAM, PKHD1 oder ATP7A.

Die Rekrutierungskapazitäten werden unter Berücksichtigung der Prävalenz seltener Krankheiten und der Aktivitäten jedes Co-Ermittlerzentrums bewertet, wie sie jährlich im Bericht der Biomedizinbehörde berichtet werden.