Implementace protokolu pro transdiferenciaci bukálního mukózního epitelu na epitel rohovky (TransBuCor)

1. Připomeňme si anatomii a histologii rohovky

   Rohovka je základní oční složkou pro vidění: často označovaná jako první „průhledný otvor“ v přední části oka. Je to první struktura, se kterou se světlo setkává při vstupu do oka. Jeho primární úlohou je konvergovat dopadající světelné paprsky, které pak postupují směrem k čočce, než dosáhnou sítnice a spustí vizuální kaskádu.

   Rohovka je avaskulární a průhledná tkáň složená z pěti vrstev: epitel rohovky, Bowmanova vrstva, stroma rohovky, Descemetova membrána a endotel rohovky.

   • Rohovkový epitel je nejvzdálenější vrstva rohovky, sestávající z rohovkových epiteliálních buněk, které tvoří asi 10 % celé rohovky. Tato vrstva se neustále regeneruje, přičemž k úplné obnově dochází každých sedm dní. Škrábance na této vrstvě se obecně dobře hojí.
   • Bowmanova vrstva pomáhá spojit rohovkový epitel a stroma dohromady. Tato vrstva se po poškození nemůže regenerovat, což může vést k trvalým jizvám, které mohou ovlivnit vidění.
   • Stroma rohovky představuje asi 90 % rohovky a je složeno z kolagenu a keratocytů.
   • Descemetova membrána je tvořena kolagenem a odděluje stroma rohovky od endotelu. Tato vrstva s věkem postupně houstne.
   • Endotel rohovky je nejvnitřnější vrstvou a napomáhá transportu tekutiny z ostatních vrstev rohovky. Poškození této vrstvy může ohrozit tento proces a negativně ovlivnit vidění člověka.

2. Proces obnovy a hojení epitelu rohovky

   Epitelové buňky rohovky se regenerují během 3 až 10 dnů neustálou obnovou z limbálních kmenových buněk umístěných na limbu (přechodná zóna mezi rohovkou a bělmou) v bazální vrstvě buněk, v pigmentových kryptách nazývaných Vogtovy palisády.

   Deficience In Limbal Stem Cells (LSCD) je charakterizována ztrátou nebo poškozením limbálních kmenových buněk, které jsou klíčové pro repopulaci rohovkového epitelu a funkci limbální bariéry.

   Etiologie LSCD může být genetická (PAX6), sekundární k chronickému zánětu (např. těžká alergická keratokonjunktivitida nebo oční rosacea), získaná infekcí, jako je herpetická keratitida, nebo sekundární k puchýřovitému onemocnění, jako je Steven-Johnsonův syndrom nebo Lyellův syndrom. LSCD lze také získat traumatem z chemických nebo tepelných popálenin. Etiologie může být také idiopatická.

   Když jsou tyto kmenové buňky ztraceny, rohovkový epitel není schopen se sám opravit a obnovit. To vede k degradaci epitelu, přetrvávajícím defektům epitelu, konjunktivalizaci, neovaskularizaci rohovky, jizvám na rohovce a chronickému zánětu. Tyto faktory přispívají k fotofobii, ztrátě jasnosti rohovky, ztrátě zraku a chronické bolesti. To znemožňuje transplantaci rohovky, protože by byla odmítnuta a/nebo by se špatně hojila.

   Současná řešení pro řešení této příčiny slepoty rohovky jsou omezená. Techniky zahrnují autologní limbální štěpy z kontralaterálního oka pacienta, ale to může představovat riziko a není možné, pokud je patologie oboustranná. Alogenní štěpy jsou vysoce rizikové pro rejekci a vyžadují systémovou imunosupresivní léčbu.

3. Slizniční štěpy v periorbitální rekonstrukci

Štěpování ústní sliznice je dobře zavedená chirurgická technika pro léčbu spojivkových nedostatků a jizev. Ústní sliznice má biologické vlastnosti podobné spojivce, přičemž obě jsou složeny z jedné nebo více vrstev epiteliálních buněk pokrývajících volnou vrstvu pojivové tkáně. Dá se sklízet opakovaně, přičemž dárcovské místo je snadno dostupné a široce dostupné. Morbidita v místě dárce je nízká a operace je pacienty obecně dobře tolerována. Kromě toho je chirurgická technika relativně jednoduchá, díky čemuž je ústní sliznice ideálním kandidátem pro náhradu anomálií spojivky.

Štěpy ústní sliznice se používají nejen pro léčbu kontrahovaných jamek u anoftalmických pacientů a rekonstrukci očního povrchu a fornixu u pacientů po resekci nádoru, ale také pro léčbu refrakčního pterygia a u pacientů s pemfigoidem nebo očním symblefaronem. Je to také nejčastěji používaná tkáň při léčbě pooperačních komplikací, včetně defektů spojivek po glaukomu, operacích sítnice, taveninách rohovky souvisejících s keratoprotézou a krytí dakryocystorinostomického traktu. Kromě toho byla orální sliznice použita k opravě neléčitelných sklerokorneálních tavenin způsobených těžkými chemickými popáleninami.

Některé týmy navrhly použití buněk bukální sliznice a jejich transdiferenciaci na limbální kmenové buňky. Dutina ústní je snadno přístupná a kmenové buňky lze izolovat ze sliznice minimálně invazivním a pro pacienta s nízkým rizikem. Tyto buňky mají vysoký diferenciační potenciál a exprimují markery embryonálních kmenových buněk; Tra2-49, Tra2-54, SSEA4, Oct4, Sox2 a Nanog, stejně jako marker neurální lišty Nestin. Zkoušky na lidech jsou však stále v přípravném stadiu a žádná terapie nebyla dosud ověřena.

V této studii zaměřené na ověření koncepce je cílem vyvinout protokol pro diferenciaci buněk ústní sliznice na limbální kmenové buňky pro použití v budoucí klinické studii s pacienty.