Role granulační tkáně v parodontální regeneraci

Tato studie si klade za cíl prozkoumat biochemické (tkáňové hojení a regenerační) a mikrobiální (infekční) vlastnosti infra- a supraoséálních granulačních tkání a porovnat tyto charakteristiky u nekuřáků a kuřáků s parodontitidou. Pro dosažení těchto cílů jsme navrhli 3 výzkumné cíle: 1. Porovnat prohojivé a regenerační vlastnosti infra- a supraoséálních granulačních tkání odebraných od nekuřáků s parodontitidou pomocí otevřených proteomických nástrojů. 2. Popsat infekční složku infra- a supraoséálních granulačních tkání odebraných od nekuřáků s parodontitidou pomocí analýzy mikrobiomu. 3. Porovnat vliv kouření na vybrané prohojivé, regenerační a virulenční markery infraoséálních granulačních tkání. Naší hlavní hypotézou je, že infraoséální a supraoséální granulační tkáně kuřáků a nekuřáků se od sebe liší z hlediska jejich prohojivých, regeneračních a mikrobiálních virulenčních vlastností a infraoséální granulační tkáň je cenným zdrojem pro regeneraci tkání po parodontální léčbě. Demografické údaje všech jednotlivců budou zaznamenány a budou zaznamenány indexy viditelného plaku na celé ústní dutině (PI%), hloubka sondážního kapes (PPD), úroveň klinického připojení (CAL) a skóre krvácení při sondáži (BoP%) ze šesti míst každého zubu. Budou pořízeny periapikální rentgenové snímky. Před chirurgickými zákroky všichni pacienti podstoupí celkové odstranění zubního kamene a ošetření kořenů. Během chirurgické léčby zbytkových kostních defektů budou nejprve odebrány vzorky supraoséální granulační tkáně. Poté bude zvednut lalok a bude odebrán vzorek intraoséální granulační tkáně. Vzorky budou umístěny do Eppendorfových zkumavek obsahujících 100 µl roztoku PBS (fosfátový pufrovaný fyziologický roztok, pH = 7,2) a budou skladovány při -80 °C až do laboratorních analýz. Proteomická analýza – vzorky tkání budou homogenizovány v 100 mM pufru hydrogenuhličitanu amonného (ABC) ve 2 ml zpevněných zkumavkách obsahujících 2,8 mm keramické kuličky (oxid zirkoničitý) (Cayman Chemical) pomocí homogenizátoru Precellys Bead Mill (Bertin). Analýza mikrobiomu – DNA bude extrahována ze vzorků tkání pomocí sady DNeasy Blood and Tissue podle doporučení výrobce (Qiagen, Německo) s menšími úpravami. Pro validaci velikosti produktu a čistoty části extraktů DNA bude použita gelová elektroforéza pomocí Tapestation 2200 (Genomic DNA a D1000 screentapes, Agilent, USA). Koncentrace DNA bude měřena pomocí Nanodropu a sady Qubit dsDNA BR Assay kit (Thermo Fisher Scientific, USA).

Cílená biochemická analýza – ze všech vzorků tkání budou změřeny hladiny prozánětlivých (IL-1β, IL-6 a TNF-α) a protizánětlivých (IL-4, IL-10) cytokinů, chemokinů souvisejících s aktivací makrofágů (monocytový chemoattraktantní protein C-C motiv chemokinový ligand 2 (CCL-2/MCP-1), C-C motiv chemokinový ligand 8 (CCL-8/ MCP-2), C-X-C motiv chemokinový ligand 9 (CXCL9/MIG) a C-C motiv ligand 3 (CCL-3/MIP-1α)) a markeru remodelace kosti (osteoprotegerin, Receptor activator of nuclear factor kappa-β ligand (RANKL), osteokalcin, osteopontin) technikami Luminex a Simoa, které dokážou detekovat tyto markery na úrovních femtogramů/ml. Multiplexní test Luminex 200 na bázi kuliček je dostupný v laboratořích Institutu zubního lékařství Univerzity v Turku. Analyzátor Simoa HD-X je dostupný v laboratořích Centrální nemocnice Univerzity v Turku. Statistická analýza: Po detekci rozdělení dat pomocí Kolmogorovova-Smirnovova testu bude ve statistické analýze použit opakovaný t-test nebo ANOVA v případě normálního rozdělení a Mann-Whitneyho U nebo Kruskalův-Wallisův test v případě nenormálního rozdělení. Při určování korelace mezi korelacemi markerů hojení a virulence bude podle rozdělení použit parametrický Pearsonův test nebo neparametrický Spearmanův test. Pro posouzení asociace mezi hladinami analytů a hojivou odpovědí bude provedena binární logistická regresní analýza s úpravou na kouření, pohlaví a věk. P < 0,05 bude považováno za významné. Etické schválení pro tento projekt bylo obdrženo od Etické komise pro výzkum Riga Stradiņš University dne 28.02.2025. (2-PĒK-4/434/2025). Každý pacient bude informován o výzkumných cílech a postupech ústně i písemným formulářem informovaného souhlasu. Bude jim sděleno, že v souladu se zákony na ochranu pacientů mají právo kdykoli z účasti odstoupit. Pacient bude také ujištěn, že odstoupení ze studie neovlivní jejich budoucí léčebný režim u jejich parodontologa. Každý pacient bude navíc informován, že data získaná během tohoto výzkumu budou použita k psaní publikací anonymním a syntetizovaným způsobem. Všechny návštěvy pacientů budou dokumentovány a každému pacientovi bude přiděleno anonymní pacientské číslo. Jakékoli potřebné opravy lékařských dokumentů budou provedeny přeškrtnutím nesprávného textu jedinou čarou a napsáním správného textu vedle něj. Klinický lékař podepíše vedle opravy. Pokud budou během studie pozorovány jakékoli vedlejší účinky, bude o tom informován Etický výbor.