Il Ruolo del Tessuto di Granulazione nella Rigenerazione Parodontale

Questo studio mira a indagare le proprietà biochimiche (guarigione tissutale e rigenerative) e microbiche (infettive) dei tessuti di granulazione infra- e supra-ossei e confrontare tali caratteristiche in pazienti con parodontite non fumatori e fumatori. Per raggiungere questi obiettivi, abbiamo progettato 3 obiettivi di ricerca: 1. Confrontare le proprietà pro-guarigione e rigenerative dei tessuti di granulazione infra- e supra-ossei prelevati da pazienti con parodontite non fumatori utilizzando strumenti di proteomica aperti. 2. Descrivere la componente infettiva dei tessuti di granulazione infra- e supra-ossei prelevati da pazienti con parodontite non fumatori utilizzando l'analisi del microbioma. 3. Confrontare l'effetto del fumo su marcatori selezionati pro-guarigione, rigenerativi e di virulenza dei tessuti di granulazione infra-ossei. La nostra ipotesi principale è che i tessuti di granulazione infra-ossei e supra-ossei di fumatori e non fumatori differiscano tra loro in termini di proprietà pro-guarigione, rigenerative e di virulenza microbica, e che il tessuto di granulazione infra-osseo sia una risorsa preziosa per la rigenerazione tissutale dopo il trattamento parodontale. I dati demografici di tutti gli individui saranno registrati, e verranno registrati l'indice di placca visibile a tutta bocca (PI%), la profondità di sondaggio della tasca (PPD), il livello di attacco clinico (CAL) e i punteggi di sanguinamento al sondaggio (BoP%) da sei siti di ciascun dente. Verranno effettuate radiografie periapicali. Prima delle applicazioni chirurgiche, tutti i pazienti riceveranno una detartrasi e levigatura radicolare a tutta bocca. Durante il trattamento chirurgico dei difetti ossei residui, verranno prima raccolti i campioni di tessuto di granulazione supra-osseo. Successivamente, verrà sollevato un lembo e verrà raccolto il campione di tessuto di granulazione intra-osseo. I campioni saranno posti in provette Eppendorf contenenti 100 µl di soluzione PBS (soluzione salina tamponata fosfato, pH = 7,2) e saranno conservati a -80°C fino alle analisi di laboratorio. Analisi proteomica - i campioni tissutali saranno omogeneizzati in tampone bicarbonato di ammonio 100 mM (ABC) in provette rinforzate da 2 ml contenenti perle di ceramica (ossido di zirconio) da 2,8 mm (Cayman Chemical) utilizzando l'omogeneizzatore a mulino a perle Precellys (Bertin). Analisi del microbioma - il DNA verrà estratto dai campioni tissutali utilizzando il kit DNeasy Blood and Tissue seguendo le raccomandazioni del produttore (Qiagen, Germania) con lievi modifiche. L'elettroforesi su gel utilizzando Tapestation 2200 (nastri Genomic DNA e D1000, Agilent, USA) verrà utilizzata per convalidare la dimensione del prodotto e la purezza di un sottoinsieme di estratti di DNA. La concentrazione di DNA verrà misurata utilizzando sia Nanodrop che il kit Qubit dsDNA BR Assay (Thermo Fisher Scientific, USA).

Analisi biochimica mirata - da tutti i campioni tissutali verranno misurati i livelli di citochine proinfiammatorie (IL-1β, IL-6 e TNF-α) e antinfiammatorie (IL-4, IL-10), chemochine correlate all'attivazione dei macrofagi (proteina chemoattrattante monocitaria ligando chemochinico motivo C-C 2 (CCL-2/MCP-1), ligando chemochinico motivo C-C 8 (CCL-8/MCP-2), ligando chemochinico motivo C-X-C 9 (CXCL9/MIG) e ligando motivo C-C 3 (CCL-3/MIP-1α)), e marcatori di rimodellamento osseo (osteoprotegerina, ligando attivatore del recettore del fattore nucleare kappa-β (RANKL), osteocalcina, osteopontina) mediante tecniche Luminex e Simoa, che possono rilevare questi marcatori a livelli di femtogrammo/ml. Il saggio multiplex basato su perle Luminex 200 è disponibile nei laboratori dell'Istituto di Odontoiatria, Università di Turku. L'analizzatore Simoa HD-X è disponibile nei laboratori dell'Ospedale Universitario Centrale di Turku. Analisi statistica: dopo il rilevamento della distribuzione dei dati con il test di Kolmogorov-Smirnov, verrà utilizzato il test t ripetuto o ANOVA in caso di distribuzione normale nell'analisi statistica, e i test U di Mann-Whitney o Kruskal Wallis in caso di distribuzione non normale. Nel determinare la correlazione tra le correlazioni dei marcatori di guarigione e virulenza, verrà utilizzato il test parametrico di Pearson o il test non parametrico di Spearman in base alla distribuzione. Verrà condotta un'analisi di regressione logistica binaria con aggiustamento per fumo, sesso ed età per valutare l'associazione tra i livelli degli analiti e la risposta di guarigione. P < 0,05 sarà considerato significativo. L'approvazione etica per questo progetto è stata ricevuta dal Comitato Etico della Ricerca dell'Università Stradiņš di Riga il 28.02.2025. (2-PĒK-4/434/2025). Ogni paziente sarà informato sugli obiettivi e le procedure della ricerca sia verbalmente che attraverso un modulo di consenso informato scritto. Sarà informato che, in conformità con le leggi sulla protezione del paziente, ha il diritto di ritirarsi dalla partecipazione in qualsiasi momento. Al paziente sarà anche assicurato che il ritiro dallo studio non influenzerà il suo futuro regime di trattamento con il suo parodontologo. Inoltre, ogni paziente sarà informato che i dati ottenuti durante questa ricerca saranno utilizzati per scrivere pubblicazioni in modo anonimo e sintetizzato. Tutte le visite dei pazienti saranno documentate e a ciascun paziente sarà assegnato un numero di paziente anonimo. Eventuali correzioni necessarie ai documenti medici saranno apportate cancellando il testo errato con una singola linea e scrivendo il testo corretto accanto ad esso. Il clinico firmerà accanto alla correzione. Se durante lo studio vengono osservati effetti collaterali, il Comitato Etico sarà informato.