O Papel do Tecido de Granulação na Regeneração Periodontal

Este estudo visa investigar as propriedades bioquímicas (cicatrização e regeneração tecidular) e microbianas (infeciosas) dos tecidos de granulação infra e supra-ósseos e comparar essas características em doentes com periodontite não fumadores e fumadores. Para atingir estes objetivos, delineámos 3 objetivos de investigação: 1. Comparar as propriedades pró-cicatrização e regenerativas dos tecidos de granulação infra e supra-ósseos colhidos de doentes com periodontite não fumadores utilizando ferramentas de proteómica de âmbito aberto. 2. Descrever o componente infecioso dos tecidos de granulação infra e supra-ósseos colhidos de doentes com periodontite não fumadores através de análise do microbioma. 3. Comparar o efeito do tabagismo em marcadores selecionados de pró-cicatrização, regeneração e virulência dos tecidos de granulação infra-ósseos. A nossa hipótese principal é que os tecidos de granulação infra e supra-ósseos de fumadores e não fumadores diferem entre si em termos das suas propriedades de pró-cicatrização, regeneração e virulência microbiana, e que o tecido de granulação infra-ósseo é um recurso valioso para a regeneração tecidual após o tratamento periodontal. Serão registados os dados demográficos de todos os indivíduos, e serão registados os índices de placa visível de boca completa (PI%), profundidade de sondagem da bolsa (PPD), nível de inserção clínica (CAL) e percentagem de sangramento à sondagem (BoP%) de seis locais de cada dente. Serão tiradas radiografias periapicais. Antes das aplicações cirúrgicas, todos os doentes receberão destartarização e alisamento radicular de boca completa. Durante o tratamento cirúrgico dos defeitos ósseos residuais, primeiro serão colhidas as amostras de tecido de granulação supra-ósseo. Posteriormente, será elevado um retalho e será colhida a amostra de tecido de granulação intra-ósseo. As amostras serão colocadas em tubos Eppendorf contendo 100 µl de solução de PBS (tampão fosfato salino, pH = 7,2) e serão armazenadas a -80°C até às análises laboratoriais. Análise de proteómica - as amostras de tecido serão homogeneizadas em tampão de bicarbonato de amónio 100 mM (ABC) em tubos reforçados de 2 ml contendo esferas de cerâmica (óxido de zircónio) de 2,8 mm (Cayman Chemical) utilizando o Homogeneizador de Esferas Precellys (Bertin). Análise do microbioma - o ADN será extraído das amostras de tecido utilizando o kit DNeasy Blood and Tissue seguindo as recomendações do fabricante (Qiagen, Alemanha) com pequenas modificações. A eletroforese em gel utilizando o Tapestation 2200 (Genomic DNA e D1000 screentapes, Agilent, EUA) será utilizada para validar o tamanho do produto e a pureza de um subconjunto dos extratos de ADN. A concentração de ADN será medida utilizando tanto o Nanodrop como o kit de ensaio Qubit dsDNA BR (Thermo Fisher Scientific, EUA).

Análise bioquímica direcionada - de todas as amostras de tecido, as citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6 e TNF-α) e anti-inflamatórias (IL-4, IL-10), as quimiocinas relacionadas com a ativação de macrófagos (proteína quimioatraente de monócitos ligando de quimiocina de motivo C-C 2 (CCL-2/MCP-1), ligando de quimiocina de motivo C-C 8 (CCL-8/MCP-2), ligando de quimiocina de motivo C-X-C 9 (CXCL9/MIG) e ligando de motivo C-C 3 (CCL-3/MIP-1α)), e os níveis do marcador de remodelação óssea (osteoprotegerina, ligando do ativador do recetor do fator nuclear kappa-β (RANKL), osteocalcina, osteopontina) serão medidos pelas técnicas Luminex e Simoa, que podem detetar estes marcadores a níveis de femtograma/ml. O ensaio multiplex baseado em esferas Luminex 200 está disponível nos laboratórios do Instituto de Medicina Dentária da Universidade de Turku. O analisador Simoa HD-X está disponível nos laboratórios do Hospital Central da Universidade de Turku. Análise estatística: Após a deteção da distribuição dos dados com o teste de Kolmogorov-Smirnov, será utilizado o teste t repetido ou ANOVA em caso de distribuição normal na análise estatística, e os testes U de Mann-Whitney ou Kruskal Wallis em caso de distribuição não normal. Na determinação da correlação entre as correlações dos marcadores de cicatrização e virulência, será utilizado o teste paramétrico de Pearson ou o teste não paramétrico de Spearman de acordo com a distribuição. Será realizada uma análise de regressão logística binária com ajuste para tabagismo, sexo e idade para avaliar a associação entre os níveis dos analitos e a resposta de cicatrização. P < 0,05 será considerado significativo. A aprovação ética para este projeto foi recebida do Comité de Ética de Investigação da Universidade Riga Stradiņs em 28.02.2025. (2-PĒK-4/434/2025). Cada doente será informado sobre os objetivos e procedimentos da investigação tanto verbalmente como através de um formulário de consentimento informado por escrito. Será notificado que, de acordo com as leis de proteção do doente, tem o direito de retirar a participação a qualquer momento. O doente também será assegurado de que a retirada do estudo não afetará o seu futuro regime de tratamento com o seu periodontologista. Adicionalmente, cada doente será informado de que os dados obtidos durante esta investigação serão utilizados para escrever publicações de forma anónima e sintetizada. Todas as visitas do doente serão documentadas, e a cada doente será atribuído um número de doente anónimo. Quaisquer correções necessárias aos documentos médicos serão feitas riscando o texto incorreto com uma única linha e escrevendo o texto correto ao lado. O clínico assinará junto à correção. Se forem observados quaisquer efeitos secundários durante o estudo, o Comité de Ética será notificado.