Rola tkanki ziarninowej w regeneracji przyzębia

Niniejsze badanie ma na celu zbadanie biochemicznych (gojenie tkanek i regeneracyjnych) oraz mikrobiologicznych (zakaźnych) właściwości pod- i nadkostnych tkanek ziarninujących oraz porównanie tych cech u pacjentów z zapaleniem przyzębia niepalących i palących. Aby osiągnąć te cele, opracowaliśmy 3 cele badawcze: 1. Porównanie właściwości progojeniowych i regeneracyjnych pod- i nadkostnych tkanek ziarninujących pobranych od niepalących pacjentów z zapaleniem przyzębia przy użyciu otwartych narzędzi proteomicznych. 2. Opisanie komponentu zakaźnego pod- i nadkostnych tkanek ziarninujących pobranych od niepalących pacjentów z zapaleniem przyzębia przy użyciu analizy mikrobiomu. 3. Porównanie wpływu palenia na wybrane markery progojeniowe, regeneracyjne i wirulencji podkostnych tkanek ziarninujących. Nasza główna hipoteza zakłada, że podkostne i nadkostne tkanki ziarninujące palaczy i niepalących różnią się od siebie pod względem właściwości progojeniowych, regeneracyjnych i mikrobiologicznej wirulencji, a podkostna tkanka ziarninująca jest cennym zasobem do regeneracji tkanek po leczeniu periodontologicznym. Dane demograficzne wszystkich osób będą rejestrowane, a pełne wskaźniki widocznej płytki nazębnej (PI%), głębokości kieszonek dziąsłowych (PPD), poziomu przyczepu klinicznego (CAL) i krwawienia przy sondowaniu (BoP%) z sześciu miejsc każdego zęba będą rejestrowane. Wykonane zostaną zdjęcia rentgenowskie zębów. Przed zabiegami chirurgicznymi wszyscy pacjenci przejdą pełne skalingowanie i opracowanie korzeni. Podczas chirurgicznego leczenia resztkowych ubytków kostnych, najpierw zostaną pobrane próbki nadkostnej tkanki ziarninującej. Następnie zostanie uniesiony płat, a próbka wewnątrzkostnej tkanki ziarninującej zostanie pobrana. Próbki zostaną umieszczone w probówkach Eppendorf zawierających 100 µl roztworu PBS (bufor fosforanowy soli fizjologicznej, pH = 7,2) i będą przechowywane w temperaturze -80°C do czasu analiz laboratoryjnych. Analiza proteomiczna – próbki tkanek będą homogenizowane w buforze 100 mM wodorowęglanu amonu (ABC) w 2 ml wzmocnionych probówkach zawierających 2,8 mm ceramiczne (tlenek cyrkonu) kulki (Cayman Chemical) przy użyciu homogenizatora Precellys Bead Mill (Bertin). Analiza mikrobiomu – DNA zostanie wyizolowane z próbek tkanek przy użyciu zestawu DNeasy Blood and Tissue zgodnie z zaleceniami producenta (Qiagen, Niemcy) z niewielkimi modyfikacjami. Elektroforeza w żelu przy użyciu Tapestation 2200 (taśmy Genomic DNA i D1000, Agilent, USA) zostanie wykorzystana do walidacji wielkości produktu i czystości podzbioru ekstraktów DNA. Stężenie DNA będzie mierzone przy użyciu zarówno Nanodrop, jak i zestawu Qubit dsDNA BR Assay (Thermo Fisher Scientific, USA).

Ukierunkowana analiza biochemiczna – we wszystkich próbkach tkanek zostaną zmierzone poziomy cytokin prozapalnych (IL-1β, IL-6 i TNF-α) i przeciwzapalnych (IL-4, IL-10), chemokin związanych z aktywacją makrofagów (białko chemotaktyczne dla monocytów C-C motif chemokine ligand 2 (CCL-2/MCP-1), C-C motif chemokine ligand 8 (CCL-8/MCP-2), C-X-C motif chemokine ligand 9 (CXCL9/MIG) i C-C motif ligand 3 (CCL-3/MIP-1α)) oraz markera przebudowy kości (osteoprotegeryna, ligand aktywatora receptora czynnika jądrowego kappa-β (RANKL), osteokalcyna, osteopontyna) przy użyciu technik Luminex i Simoa, które mogą wykrywać te markery na poziomach femtogramów/ml. Test multiplexowy Luminex 200 oparty na kulkach jest dostępny w laboratoriach Instytutu Stomatologii Uniwersytetu w Turku. Analizator Simoa HD-X jest dostępny w laboratoriach Centralnego Szpitala Uniwersyteckiego w Turku. Analiza statystyczna: Po wykryciu rozkładu danych za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa, w analizie statystycznej zostanie użyty powtarzany test t lub ANOVA w przypadku rozkładu normalnego oraz testy Manna-Whitneya U lub Kruskala-Wallisa w przypadku rozkładu nienormalnego. W określaniu korelacji między markerami gojenia i wirulencji zostanie użyty parametryczny test Pearsona lub nieparametryczny test Spearmana zgodnie z rozkładem. Analiza regresji logistycznej z dostosowaniem do palenia, płci i wieku zostanie przeprowadzona w celu oceny związku między poziomami analitów a odpowiedzią gojenia. P < 0,05 będzie uważane za istotne. Zgoda etyczna na ten projekt została otrzymana od Komisji Etyki Badań Naukowych Uniwersytetu Rīga Stradiņš w dniu 28.02.2025. (2-PĒK-4/434/2025). Każdy pacjent zostanie poinformowany o celach i procedurach badawczych zarówno ustnie, jak i poprzez pisemną formę świadomej zgody. Zostaną poinformowani, że zgodnie z prawem ochrony pacjentów, mają prawo wycofać się z udziału w dowolnym momencie. Pacjent zostanie również zapewniony, że wycofanie się z badania nie wpłynie na jego przyszły schemat leczenia u periodontologa. Dodatkowo, każdy pacjent zostanie poinformowany, że dane uzyskane podczas tego badania zostaną wykorzystane do napisania publikacji w sposób anonimowy i zsyntetyzowany. Wszystkie wizyty pacjentów będą dokumentowane, a każdemu pacjentowi zostanie przypisany anonimowy numer pacjenta. Wszelkie niezbędne poprawki w dokumentacji medycznej zostaną dokonane przez przekreślenie nieprawidłowego tekstu pojedynczą linią i napisanie poprawnego tekstu obok. Klinicysta podpisze się obok poprawki. Jeśli podczas badania zaobserwowane zostaną jakiekolwiek skutki uboczne, Komisja Etyki zostanie powiadomiona.