miR-142-3p als potenzieller Biomarker für Synaptopathie bei MS

In den letzten zehn Jahren sind strukturelle und funktionelle synaptische Veränderungen, die zusammenfassend als Synaptopathie bekannt sind, als entscheidender pathologischer Prozess aufgetreten, der zu den neurodegenerativen Schäden bei Multipler Sklerose (MS) und ihrem Mausmodell, der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), beiträgt. Da synaptische Veränderungen und Verluste im Gegensatz zum Verlust von Neuronen reversibel sind, könnte eine frühzeitige Erkennung eine frühzeitige klinische Intervention mit potenziell besseren therapeutischen Ergebnissen ermöglichen, aber zuverlässige Biomarker sind noch nicht verfügbar.

Mikro-RNAs (miRs), die in den Zerebrospinalflüssigkeiten (CSF) zirkulieren, sind gute Kandidaten als mögliche sensitive Biomarker für das durch MS-Synaptopathie bedingte Fortschreiten der Erkrankung. Sie repräsentieren eine neue Klasse von Modulatoren der Genexpression mit stabiler Anwesenheit in den Körperflüssigkeiten und mit einer kritischen Rolle in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen, insbesondere im Zentralnervensystem. Dementsprechend wurde kürzlich gezeigt, dass miR-142-3p eine entscheidende Komponente in einer schädlichen regulatorischen Achse von exzitotoxischen synaptischen Dysfunktionen von EAE/MS ist, indem es den Spiegel des glialen Glutamat-Aspartat-Transporters/exzitatorischen Aminosäuretransporters 1 (GLAST/EAAT1 ) Protein. Darüber hinaus sind die miR-142-3p-Spiegel sowohl im EAE-Gehirn als auch im Liquor von Patienten mit schubförmig remittierender MS (RRMS) erhöht und korrelieren mit dem Fortschreiten der Erkrankung. Vorläufige Daten zeigen auch, dass miR-142-3p ein direktes Ziel verschiedener pharmakologischer Behandlungen für MS ist, während die Wirkung nicht-pharmakologischer Behandlungen wie therapeutischer transkranieller Magnetstimulation (TMS) zur Linderung von MS-Spastizität noch unbekannt ist.

Auf der Grundlage dieser Überlegungen wird eine prospektive und retrospektive Kohortenstudie über etwa sechs Jahre durchgeführt, um zu beurteilen, ob miR-142-3p ein möglicher Biomarker für die MS-Synaptopathie-getriebene Krankheitsprogression (AIM1) und für die Wirksamkeit krankheitsmodifizierender Behandlungen ist ( DMTs), die derzeit in der MS-Therapie verwendet werden (AIM2a). Darüber hinaus wird ein genetisches Screening aus peripherem Blut durchgeführt, um Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) in kodierenden und/oder regulierenden Regionen der miR-142-3p- und GLAST/EAAT1-Gene zu identifizieren, die mit MS-Synaptopathie (AIM2b) assoziiert sind. Schließlich wird ein repetitives TMS-Stimulationsprotokoll (iTBS) in einer Untergruppe von gescreenten MS-Patienten mit Spastizität der unteren Extremitäten (interventionelle Unterstudie) durchgeführt, um das Ansprechen des Patienten auf die Behandlung in Verbindung mit den identifizierten SNPs (AIM2c) zu bewerten.

Angesichts der Heterogenität und Komplexität der MS-Erkrankung wird ein multivariabler Ansatz es ermöglichen, den Beitrag von miR-142-3p zum durch Synaptopathie beeinflussten MS-Verlauf zu analysieren (AIM1).

Zunächst werden die miR-142-3p-Spiegel im MS-CSF (am Tag der Rekrutierung, T0) mit anderen möglichen Variablen korreliert, die für den Krankheitsverlauf relevant sind, wie z. B.:

• klinisch (Krankheitsdauer, geschätzt als Anzahl der Jahre vom Beginn bis zur letzten Feststellung der Behinderung; Behinderung, bewertet mit EDSS = Expanded Disability Status Scale; Progressionsindex, PI = EDSS/Krankheitsdauer; Veränderung der ARR = Annualisierte Schubrate) und neuroradiologische Parameter (Dual-Echo-Protonendichte; FLAIR = fluid-attenuated inversion recovery; T2-WI = T2-gewichtete Spin-Echo-Bilder und T1-WI = Pre-Kontrast- und Post-Kontrast-T1-gewichtete Spin-Echo-Bilder nach intravenöser Gabe Gadolinium (Gd)-Infusion) zu T0 und einmal jährlich während einer 6-jährigen Nachbeobachtung, wenn kein Rückfall auftritt (T12, T24, T36, T48, T60, T72);
• Spiegel entzündlicher und potenziell exzitotoxischer Proteinfaktoren (wie IL-1β, TNF und RANTES-CCL5) im Liquor (T0);
• Spiegel von Neurofilamenten, Beta-Amyloid, Tau-Proteinen und Wachstumsfaktoren (wie NGF, PDGF und BDNF) im Liquor als mögliche Indikatoren für neurodegenerative und regenerative Prozesse, die beim Liquorentzug (T0) auftreten.

Um die variable Dimension zu reduzieren, wird die Hauptkomponentenanalyse (PCA) angewendet, wobei der Beitrag von miR-142-3p zum Krankheitsverlauf als Teil eines komplexen Netzwerks von Molekülen, die im Liquor zirkulieren, berücksichtigt wird, und univariable und multivariable Korrelationen werden wiederholt .

In der multivariablen Analyse (basierend auf multivariablen generalisierten linearen Modellen, GLM) werden die miR-142-3p-Spiegel im Liquor (oder PCA-Komponenten einschließlich miR-142-3p als Teil der Komponente) als unabhängige Variable betrachtet, die um demografische, klinische und neuroradiologische Werte sowie verschiedene DMT-Behandlungen. Eine weitere Analyse anhand von Behandlungsstratifizierungen der Patienten wird versucht (AIM2a).

Schließlich werden die CSF-Spiegel von miR-142-3p (oder PCA-Komponenten einschließlich miR-142-3p), die identifiziert wurden, um mit Krankheitsprogressionsvariablen in Verbindung zu stehen, mit neurophysiologischen Parametern korreliert, die mittels TMS aufgezeichnet werden, um die kortikale Erregbarkeit und Plastizität (SICI = kurzintervallige intrakortikale Hemmung; ICF = intrakortikale Fazilitation; LICI = langintervallige intrakortikale Hemmung; PAS = gepaarte assoziative Stimulation) bei MS-Patienten bei T0. Daher wird miR-142-3p, das im Liquor zirkuliert, als möglicher Biomarker für synaptopathiegetriebene Krankheitsprogression (als einzelnes Molekül oder als Teil einer PCA-Komponente) validiert.

Um genetische Varianten von miR-142-3p- und GLAST/EAAT1-codierenden Genen zu identifizieren, die für MS-Synaptopathie (AIM2b) relevant sind, werden SNPs bei T0 analysiert und mit miR-142-3p-Spiegeln im Liquor und mit anderen möglichen relevanten Variablen korreliert Krankheitsverlauf wie in AIM1. PCA- und GLM-Modelle werden wie in AIM1 angewendet.

Bewertung des Ansprechens auf die Behandlung in der Subgruppe von gescreenten MS-Patienten, die in die interventionelle Substudie eingeschlossen waren, basierend auf einem zweiwöchigen Protokoll von iTBS zur Reduzierung der Spastik der unteren Extremitäten, des H/M-Amplitudenverhältnisses des Soleus-H-Reflexes und der modifizierten Ashworth-Skala (MAS) werden vor (W0) und nach (W2) dem Stimulationsprotokoll betrachtet. Ein möglicher Zusammenhang zwischen der Reaktion des Patienten auf das iTBS-Stimulationsprotokoll und spezifischen SNPs wird bewertet (AIM2c).

Die statistische Analyse wird mit Prism GraphPad 6.0, IBM SPSS Statistics 15.0, R-Software und T-MEV 4.4.1 durchgeführt. Die Daten werden durch die Kolmogorov-Smirnov- und Shapiro-Wilk-Tests auf Normalverteilung getestet. Die k-Means-Methode wird verwendet, um MS-Patienten basierend auf miR-142-3p-Spiegeln im Liquor und anderen relevanten Parametern in homogene Cluster einzuteilen. Unterschiede zwischen zwei Gruppen werden je nach Bedarf unter Verwendung des Student-t-Tests, des Mann-Whitney-Tests, des exakten Fisher-Tests oder des Log-Rank-Tests analysiert; Mehrfachvergleiche werden von ANOVA gefolgt von Tukey HSD oder von Kruskal-Wallis durchgeführt. Pearson- oder nichtparametrische Spearman-Korrelationskoeffizienten werden durchgeführt, um die Assoziation von miR-142-3p-Spiegeln im Liquor oder spezifischen genetischen Varianten von MIR142 und SLC1A3 (oder der entsprechenden PCA-Komponente, siehe unten) mit kontinuierlichen demografischen, klinischen und neuroradiologischen Parametern zu bewerten ( B. Alter, Veränderungen des EDSS, Anzahl der T2-Läsionen usw.). Für die Mehrfachvergleiche wird die False Discovery Rate (FDR) nach der von Benjamini und Hochberg vorgeschlagenen Methode kontrolliert.

PCA wird angewendet, um Sätze potenziell korrelierter Variablen (CSF-Spiegel von miR-142-3p oder spezifische genetische Varianten von MIR142 und SLC1A3, entzündliche und potenziell exzitotoxische Proteinfaktoren und Spiegel von Neurofilamenten, Beta-Amyloid, Tau-Protein und Wachstumsfaktoren) darzustellen Hauptkomponenten (PC), die linear unkorreliert sind und durch orthogonale Transformation erhalten werden. PCs werden so geordnet, dass der erste PC die größtmögliche Varianz aufweist und nur einige Komponenten ausgewählt werden, um die korrelierten Variablen darzustellen. Dadurch wird die Dimension der Variablen reduziert.

Um miR-142-3p als Biomarker für synaptopathiebedingte Krankheitsprogression (gemessen an klinischen oder radiologischen Veränderungen und TMS-Variablen) oder spezifische SNPs von MIR142 und SLC1A3 im Zusammenhang mit MS-Synaptopathie zu validieren, werden GLM-Modelle unter Berücksichtigung der jeweils angewendet miR-142-3p-Spiegel im Liquor (oder die identifizierten PCA-Komponenten einschließlich miRs) oder die genetischen Varianten als unabhängige Variable, die für demografische, klinische, neuroradiologische, neurophysiologische, biochemische Faktoren und Behandlungen angepasst wird.

Die Daten werden als Mittelwert (Standardabweichung, sd) oder Median (25.–75. Perzentil) dargestellt. Das Signifikanzniveau wird auf p < 0,05 festgelegt.