miR-142-3p come potenziale biomarcatore di sinaptopatia nella SM

Nell'ultimo decennio, le alterazioni sinaptiche strutturali e funzionali, note collettivamente come sinaptopatia, sono diventate un processo patologico determinante che contribuisce al danno neurodegenerativo nella sclerosi multipla (SM) e nel suo modello murino, l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Poiché l'alterazione e la perdita sinaptica sono reversibili, a differenza della perdita di neuroni, una diagnosi precoce potrebbe consentire un intervento clinico precoce con esiti terapeutici potenzialmente migliori, ma non sono ancora disponibili biomarcatori affidabili.

I microRNA (miR) circolanti nei fluidi cerebrospinali (CSF) sono buoni candidati come possibili biomarcatori sensibili per la progressione della malattia guidata dalla sinaptopatia della SM. Rappresentano una nuova classe di modulatori dell'espressione genica con presenza stabile nei fluidi corporei e con un ruolo critico in molti processi fisiologici e patologici, specialmente nel sistema nervoso centrale. Di conseguenza, è stato recentemente dimostrato che miR-142-3p è un componente cruciale in un asse normativo dannoso delle disfunzioni sinaptiche eccitotossiche EAE/MS, riducendo il livello del trasportatore gliale di glutammato aspartato/trasportatore di aminoacidi eccitatori 1 (GLAST/EAAT1 ) proteine. Inoltre, i livelli di miR-142-3p sono aumentati sia nel cervello EAE che nel liquido cerebrospinale dei pazienti con SM recidivante-remittente (RRMS) e sono correlati alla progressione della malattia. Dati preliminari rivelano anche che miR-142-3p è il bersaglio diretto di diversi trattamenti farmacologici per la SM, mentre l'azione di trattamenti non farmacologici, come la stimolazione magnetica transcranica terapeutica (TMS) per migliorare la spasticità della SM, è ancora sconosciuta.

Sulla base di queste considerazioni, verrà condotto uno studio di coorte prospettico e retrospettivo di circa sei anni per valutare se il miR-142-3p sia un possibile biomarcatore per la progressione della malattia guidata dalla sinaptopatia della SM (AIM1) e per l'efficacia dei trattamenti modificanti la malattia. DMT) attualmente utilizzati nella terapia della SM (AIM2a). Inoltre, verrà condotto uno screening genetico da sangue periferico per identificare polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) nelle regioni codificanti e/o regolatrici dei geni miR-142-3p e GLAST/EAAT1, associati alla sinaptopatia MS (AIM2b). Infine, un protocollo di stimolazione TMS ripetitiva (iTBS) sarà eseguito in un sottogruppo di pazienti con SM schermati con spasticità degli arti inferiori (sottostudio interventistico) per valutare la risposta del paziente al trattamento legato agli SNP identificati (AIM2c).

Data l'eterogeneità e la complessità della malattia della SM, l'approccio multivariabile consentirà di sezionare il contributo di miR-142-3p al decorso della SM influenzato dalla sinaptopatia (AIM1).

In primo luogo, i livelli di miR-142-3p nella SM CSF (il giorno del reclutamento, T0) saranno correlati con altre possibili variabili rilevanti per la progressione della malattia, come:

• clinico (durata della malattia, stimata come il numero di anni dall'esordio alla più recente valutazione della disabilità; disabilità, valutata utilizzando EDSS = Expanded Disability Status Scale; Indice di progressione, PI = EDSS/durata della malattia; variazione dell'ARR = tasso di ricaduta annualizzato) e parametri neuroradiologici (densità protonica dual-echo; FLAIR = recupero dell'inversione attenuata dal fluido; T2-WI = immagini spin-echo pesate in T2 e T1-WI = immagini spin-echo pesate in T1 pre-contrasto e post-contrasto dopo somministrazione endovenosa infusione di gadolinio (Gd)) a T0 e una volta all'anno durante un follow-up di 6 anni se non si verifica alcuna recidiva (T12, T24, T36, T48, T60, T72);
• livelli di fattori proteici infiammatori e potenzialmente eccitotossici (come IL-1β, TNF e RANTES-CCL5) nel liquido cerebrospinale (T0);
• livelli di neurofilamenti, beta amiloide, proteine ​​tau e fattori di crescita (come NGF, PDGF e BDNF) nel liquor, come possibili indicatori di processi neurodegenerativi e rigenerativi che si verificano al ritiro del liquor (T0).

Per ridurre la dimensione variabile, verrà applicata l'analisi delle componenti principali (PCA) tenendo conto del contributo del miR-142-3p alla progressione della malattia come parte di una complessa rete di molecole circolanti nel CSF, e verranno ripetute correlazioni univariabili e multivariabili .

Nell'analisi multivariata (basata su modelli lineari generalizzati multivariabili, GLM), i livelli di miR-142-3p nel CSF (o componenti PCA che includono miR-142-3p come parte del componente) saranno considerati come la variabile indipendente aggiustata per dati demografici, valori clinici e neuroradiologici nonché diversi trattamenti DMT. Verrà tentata un'ulteriore analisi basata sulle stratificazioni terapeutiche dei pazienti (AIM2a).

Infine, i livelli CSF di miR-142-3p (o componenti PCA incluso miR-142-3p) identificati per associarsi a variabili di progressione della malattia saranno correlati con parametri neurofisiologici, registrati mediante TMS per valutare l'eccitabilità e la plasticità corticale (SICI = inibizione intracorticale a breve intervallo; ICF = facilitazione intracorticale; LICI = inibizione intracorticale a lungo intervallo; PAS = stimolazione associativa accoppiata) nei pazienti con SM a T0. Pertanto, i miR-142-3p circolanti nel CSF saranno convalidati come possibili biomarcatori della progressione della malattia guidata dalla sinaptopatia (come singole molecole o come parte di un componente PCA).

Per identificare le varianti genetiche dei geni codificanti per miR-142-3p e GLAST/EAAT1 rilevanti per la sinaptopatia MS (AIM2b) gli SNP saranno analizzati a T0 e saranno correlati con i livelli di miR-142-3p nel CSF e con altre possibili variabili rilevanti per progressione della malattia come in AIM1. I modelli PCA e GLM saranno applicati come in AIM1.

Per valutare la risposta al trattamento nel sottogruppo di pazienti con SM sottoposti a screening inclusi nel sottostudio interventistico basato su un protocollo di due settimane di iTBS per ridurre la spasticità degli arti inferiori, il rapporto di ampiezza H/M del riflesso Soleus H e la scala di Ashworth modificata (MAS) saranno considerati prima (W0) e dopo (W2) il protocollo di stimolazione. Verrà valutata la possibile associazione tra la risposta del paziente al protocollo di stimolazione iTBS e SNP specifici (AIM2c).

L'analisi statistica verrà eseguita utilizzando Prism GraphPad 6.0, IBM SPSS Statistics 15.0, software R e T-MEV 4.4.1. I dati saranno testati per la distribuzione di normalità attraverso i test di Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk. Il metodo k-means sarà utilizzato per dividere i pazienti affetti da SM in gruppi omogenei, basati sui livelli di miR-142-3p nel liquido cerebrospinale e altri parametri rilevanti. Le differenze tra i due gruppi saranno analizzate utilizzando il test t di Student, il test di Mann-Whitney, il test esatto di Fisher o il test log-rank, a seconda dei casi; confronti multipli saranno eseguiti mediante ANOVA seguita da Tukey HSD o da Kruskal-Wallis. Saranno eseguiti coefficienti di correlazione di Pearson o Spearman non parametrici per valutare l'associazione dei livelli di miR-142-3p nel CSF o specifiche varianti genetiche di MIR142 e SLC1A3 (o il corrispondente componente PCA, vedi dopo) con parametri demografici, clinici e neuroradiologici continui ( es. Età, cambiamenti nell'EDSS, Numero di lesioni T2, ecc.). Per i confronti multipli sarà controllato il False Discovery Rate (FDR) applicando il metodo proposto da Benjamini e Hochberg.

La PCA sarà applicata per rappresentare insiemi di variabili potenzialmente correlate (livelli CSF di miR-142-3p o varianti genetiche specifiche di MIR142 e SLC1A3, fattori proteici infiammatori e potenzialmente eccitotossici e livelli di neurofilamenti, beta amiloide, proteina tau e fattori di crescita) con componenti principali (PC) linearmente non correlate ottenute mediante trasformazione ortogonale. I PC sono ordinati in modo che il primo PC abbia la massima varianza possibile e solo alcuni componenti sono selezionati per rappresentare le variabili correlate. Di conseguenza, la dimensione delle variabili è ridotta.

Per convalidare miR-142-3p come biomarcatore della progressione della malattia guidata dalla sinaptopatia (misurata in termini di cambiamenti clinici o radiologici e variabili TMS) o SNP specifici di MIR142 e SLC1A3 legati alla sinaptopatia MS, verranno applicati modelli GLM considerando, rispettivamente, il livello di miR-142-3p nel liquido cerebrospinale (o nei componenti PCA identificati inclusi i miR) o nelle varianti genetiche come variabile indipendente che si adatta a fattori e trattamenti demografici, clinici, neuroradiologici, neurofisiologici, biochimici.

I dati saranno presentati come media (deviazione standard, ds) o mediana (25°-75° percentile). Il livello di significatività è stabilito a p<0.05.