Órganos dañados por sepsis: identificación de marcadores dobles de insuficiencia orgánica mediante análisis de seguimiento de nanopartículas fluorescentes

Antecedentes: la sepsis, definida como una disfunción orgánica que pone en peligro la vida debido a una respuesta desregulada del huésped a la infección, continúa siendo una fuente de morbilidad y mortalidad considerables. Cada año se ven 19 millones de casos en todo el mundo. Muchos modelos animales de sepsis habían encontrado que la sepsis inducía falla orgánica múltiple. La ubiquitinación, la autofagia y la apoptosis pueden implicar el proceso de insuficiencia orgánica múltiple relacionada con la sepsis. Los estudios de proteómica basados ​​en espectrometría de masas en poblaciones clínicas y en modelos animales de roedores y mamíferos habían comenzado con el descubrimiento de muchos biomarcadores novedosos de sepsis. Los esoxomas que se habían encontrado en sangre u orina presentaban la señal de autofagia y apoptosis. Recientemente, el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) se utilizó como un nuevo método para el análisis directo y en tiempo real de los exosomas. Estos permiten estudiar los biomarcadores de exosomas para analizar pacientes sépticos con falla multiorgánica.

Objetivos del estudio: Esta investigación será el primer estudio no solo en establecer macrófagos cocultivados con modelos de células de órganos humanos para las secreciones de exosomas, sino también en recolectar exosomas purificados en sangre y orina de pacientes sépticos. Estudios de proteómica en exosomas de cultivos celulares y muestras clínicas. Analice biomarcadores de exosomas relacionados con la ubiquitinación, el autofago y la apoptosis mediante bioinformática. Use NTA para establecer métodos de diagnóstico nuevos, para juzgar el daño orgánico específico del paciente séptico mediante biomarcadores de autofagia-apoptosis de exosomas.

Materiales y métodos: en el primer año, se establecerán macrófagos estimulados con LPS (lipopolisacárido) cocultivados con células de órganos humanos. Los exosomas se aislarán y purificarán de diferentes grupos. Se seleccionará ScFv (fragmentos de cadena única de anticuerpo) para bloquear la transmisión de exosomas relacionada con la infección. El 2º año se incluirán un total de 60 pacientes con infección y cultivo positivo, de los cuales 30 pacientes sépticos tuvieron al menos una falla orgánica, los demás solo tendrán infección. Todos los pacientes incluidos y clasificados según los criterios de sepsis-3. Las muestras clínicas se recolectarán desde agosto de 2017 hasta julio de 2019. El exosoma se aislará y purificará. La purificación de perlas magnéticas, la electroforesis en gel 2D, MALDI-TOF y la bioinformática se utilizarán para analizar la proteómica de los exosomas y la asociación de marcadores específicos de órganos, autofagia y marcadores de apoptosis. Se realizará una transferencia Western para probar las proteínas encontradas por proteómica. La matriz de citoquinas en la sangre también confirma y se correlaciona con la autofagia. Finalmente, utilizaremos el análisis de seguimiento de nanopartículas con identificación de marcadores dobles para comprender las subpoblaciones de exosomas de biomarcadores específicos de órganos y autofagia-apoptosis.

Posible efecto: se realizará el establecimiento sistemático de la proteómica de exosomas en medio de cultivo conjunto y muestras clínicas de sepsis. Estudio in vitro, la exploración de ScFv ayudará a bloquear la captación de exsomas como posible método terapéutico. Los biomarcadores de ubiquitinación-autofagia-apoptosis en los exosomas se detectarán y correlacionarán con la insuficiencia orgánica específica en la sepsis. El proceso inflamatorio también será validado por análisis de citoquinas. La identificación de marcadores dobles de NTA será un método inteligente para comprender las subpoblaciones de exosomas.