Identificação de marcadores duplos de órgãos danificados por sepse de falha de órgão usando análise de rastreamento de nanopartículas fluorescentes

Introdução: A sepse, definida como uma disfunção orgânica com risco de vida devido a uma resposta desregulada do hospedeiro à infecção, continua a ser uma fonte considerável de morbidade e mortalidade. 19 milhões de casos são vistos em todo o mundo a cada ano. Muitos modelos animais de sepse descobriram que a sepse induzia à falência de múltiplos órgãos. Ubiquitinação, autofagia e apoptose podem envolver o processo de falência múltipla de órgãos relacionada à sepse. Estudos proteômicos baseados em espectrometria de massa em populações clínicas e em modelos animais de roedores e mamíferos começaram com a descoberta de muitos novos biomarcadores de sepse. Esoxomas foram encontrados no sangue ou urina apresentaram o sinal de autofagia e apoptose. Recentemente, a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) foi usada como um novo método para análise direta e em tempo real de exossomos. Estes permitem estudar os biomarcadores exossomais para analisar pacientes sépticos com falência de múltiplos órgãos.

Objetivos do estudo: Esta pesquisa será o primeiro estudo não apenas a estabelecer macrófagos co-cultivados com modelos de células de órgãos humanos para secreções de exossomos, mas também coletar exossomos purificados no sangue e na urina de pacientes sépticos. Estudos de proteômica em exossomos de cultura de células e espécimes clínicos. Analisar biomarcadores de exossomos relacionados à ubiquitinação, autofago e apoptose por bioinformática. Use o NTA para configurar novos métodos de diagnóstico, para avaliar o dano de órgão específico do paciente séptico por biomarcadores de autofagia-apoptose de exossomos.

Materiais e Métodos: No 1º ano, serão preparados macrófagos estimulados por LPS (lipopolissacarídeo) co-cultivados com células de órgãos humanos. Exossomos serão isolados e purificados de diferentes grupos. ScFv (fragmentos de cadeia simples de anticorpo) serão selecionados para bloquear a transmissão de exossomos relacionados à infecção. No 2º ano, serão incluídos um total de 60 pacientes com infecção e resultados de cultura positivos, dos quais 30 pacientes sépticos tiveram pelo menos uma falência de órgão, outros terão apenas infecção. Todos os pacientes incluídos e classificados de acordo com os critérios de sepse-3. As amostras clínicas serão coletadas de agosto de 2017 a julho de 2019. O exossomo será isolado e purificado. Purificação de esferas magnéticas, eletroforese em gel 2D, MALDI-TOF e bioinformática serão usados ​​para analisar proteômica de exossomos e associação de marcadores órgão-específicos, autofagia e marcadores de apoptose. Western blotting será feito para comprovar as proteínas encontradas pela proteômica. A disposição das citocinas no sangue também confirma e se correlaciona com a autofagia. Por fim, usaremos análise de rastreamento de nanopartículas com identificação de marcadores duplos para entender as subpopulações de exossomos de órgãos específicos e biomarcadores de autofagia-apoptose.

Possível efeito: Será feito o estabelecimento sistemático de proteômica de exossomos em meio de co-cultura e espécimes de sepse clínica. Estudo in vitro, explorando ScFv ajudará a bloquear a captação de exsomes como um possível método terapêutico. Biomarcadores de ubiquitinação-autofagia-apoptose em exossomos serão detectados e correlacionados com falência de órgãos específicos na sepse. O processo inflamatório também será validado pela análise de citocinas. A identificação de marcadores duplos NTA será um método inteligente para entender as subpopulações de exossomos.