Endomikroskopia ja siirrännäis-isäntätauti

GvHD-tauti (GvHD) on merkittävä sairastuvuuden ja kuolleisuuden syy potilailla, joille tehtiin hematopoieettinen kantasolusiirto (HSCT) [1]. Ruoansulatuskanavassa yhtenä GvHD:n tärkeimmistä kohdeelimistä voi olla vaikeaa diagnosoida monia samanlaisia ​​erotusdiagnooseja, joista merkittävimmät ovat sytomegalovirusinfektiot [2]. Asiantuntijat ovat eri mieltä parhaasta diagnostisesta lähestymistavasta potilaille, joita epäillään akuutista gastrointestinaalisesta GvHD:stä (aGI-GvHD). On tehty monia tutkimuksia, jotka tukevat maha-suolikanavan alemman [3, 4, 5], yläosan [6, 7] tai molempien osien endoskooppista arviointia [8, 9]. Kummassakin tapauksessa koepalanäytteiden histologinen arviointi toimii vakiovälineenä lopullisen diagnoosin määrittämisessä [10].

Ottaen huomioon potilaiden melko huonon yleistilan HSCT:n jälkeen endoskooppista ja histologista arviointia rajoittavana tekijänä, aGI-GvHD:n diagnostiseen käsikirjaan on lisätty uusia lähestymistapoja invasiivisten tutkimusten määrän vähentämiseksi. Perinteiset kuvantamistekniikat, kuten magneettikuvaus [11], tietokonetomografia [12] ja korkearesoluutioinen ultraääni Doppler-kuvauksella [13], raportoivat suolen seinämän paksuuntumisesta GvHD-potilailla. Mutta koska tällaiset löydökset ovat vain epäspesifisiä merkkejä maha-suolikanavan patologiasta, tavanomaiset kuvantamistekniikat eivät voi korvata endoskopiaa biopsioilla [14]. Sama pätee videokapseliendoskopiaan, jolla todettiin todellakin olevan korkea negatiivinen ennustearvo aGI-GvHD:n havaitsemiseksi, mutta jakaa tärkeä puute, että biopsianäytteitä puuttuu histologista arviointia varten [15, 16, 17].

Ainakin tämä menetelmä siirsi kiinnostuksen painopisteen ohutsuoleen. Tästä aiemmasta laiminlyötystä GI-osasta saadut biopsiat olivat osoittaneet suurta herkkyyttä GvHD:hen liittyville muutoksille aiemmissa tutkimuksissa [18]. Koska samanlaisia ​​tuloksia nähtiin tutkimuspaikalla, tutkijat vertasivat enteroskopiaa biopsioiden kanssa nykyiseen kultastandardiin diagnostisessa aGI-GvHD:n hoidossa, kolonoskopiassa biopsioiden kanssa. Tämän tutkimuksen yhteydessä paksusuole osoitti paljon voimakkaampaa kiintymystä aGI-GvHD:hen kuin kaikki muut paikat, vaikka ei ollut paria tutkimuksia, joissa kolonoskopia paljastaisi aGI-GvHD:n ilman tällaisia ​​löydöksiä enteroskopiassa. Päinvastoin, enteroskopia paljasti jopa GvHD:hen liittyviä patologioita yhdessä tapauksessa, jossa vastaava kolonoskopia jäi huomaamatta. Tämän seurauksena he olettivat, että enteroskooppiset löydökset voivat korvata kolonoskopian tarpeen [19], minkä vuoksi HSCT:n jälkeen potilaat voivat jäädä ilman stressaavaa suolen valmistelua, jota usein rajoittaa heidän melko huono yleiskuntonsa.

Yksi viimeisimmistä kehityksestä maha-suolikanavan endoskooppisessa hoidossa on ns. konfokaalinen laserendomikroskooppi (CLE). Konfokaalimikroskopian kehitti Marvin Minsky 1950-luvun lopulla. Sen periaate on kohteen pinnan alla olevien polttopisteiden mikroskooppinen skannaus. Perinteiseen valomikroskopiaan verrattuna se käyttää erityistä suodatinjärjestelmää estämään kuvan päällekkäisyys ympäröivän kudoksen kanssa. Yksityiskohtaisesti valonlähde (yleensä laser) fokusoidaan mikroskoopin objektiivilinssillä diffraktiolla rajoitettuun kohtaan kohteen päällä tai sisällä. Valo, joka on sironnut tai fluoresenssiviritetty (saavutettu esimerkiksi fluoreseiinivärjäyksellä) ja säteilee näytteen fokuspisteessä, palaa osittain takaisin optiikkaa pitkin polkua, josta se saapui. Reitille sijoitettu säteenjakaja heijastaa paluuvaloa kohti ilmaisinta. Optiikka fokusoi valon näytteen polttopisteestä sen konjugoituun fokusointiin lähellä ilmaisinta (täten tekniikkaa kutsutaan "kon-fokaaliseksi"). Tässä spatiaalista suodatinta ("pinhole") käytetään sammuttamaan kaikki valo, joka tulee polttopisteen ulkopuolelta. Valon heijastukset itse polttopisteestä välitetään ilmaisimeen, joka on kytketty tietokonejärjestelmään, joka digitalisoi optisen signaalin ja luo in vivo histologisen kuvan [20].

Kliiniseen vaikutukseensa keskittyvä konfokaalinen mikroskopia on ensimmäinen tekniikka, joka mahdollistaa niiden pinnan alla olevien kudosrakenteiden arvioinnin in vivo. Monien miniatyrisoinnin läpimurtojen vuoksi (enimmäkseen 1990-luvulla) tätä tekniikkaa voitiin soveltaa intraluminaaliseen käyttöön gastroenterologiassa integroituna muuten tavalliseen endoskooppiin. Se mahdollistaa kaikkien maha-suolikanavan seinämien ylempien 250 mikrometrin histologisen visualisoinnin in vivo valkoisen valon endoskopian normaalin toiminnan lisäksi (joka tarjoaa kaksi erillistä näyttöä työaseman päällä) [20].

Bojarski et al. raportoivat ensimmäisen CLE:n kliinisen käytön tulevassa pilottitutkimuksessa, johon osallistui 35 potilasta HSCT:n jälkeen. vuonna 2009. Paksusuolen limakalvon CLE saattoi ennustaa positiivisen aGI-GvHD-diagnoosin 14 potilaalla 19:stä, mikä vahvistettiin myöhemmin histologisella arvioinnilla. AGI-GvHD:n in vivo -löydökset, jotka vaihtelivat yksittäisen kryptan apoptoosista täydelliseen kryptan katoamiseen, olivat selvästi erotettavissa muun alkuperän patologioista, kuten tarttuvasta paksusuolitulehduksesta tai haavaisesta paksusuolitulehduksesta, joita molempia käytettiin vertailuna [21].

Opintojen tavoitteet

Tässä kliinisessä tutkimuksessa tutkijat aikovat jatkaa akuutin gastrointestinaalisen siirrännäis-isäntätaudin (aGI-GvHD) diagnostista lähestymistapaa. Tutkimuslaitoksen viimeaikaisten tulosten perusteella (selvitetty yllä, [19]), jotka osoittivat huomattavan diagnostisen tuoton aGI-GvHD:hen liittyville patologioille ohutsuolessa, tutkijat aikovat arvioida ohutsuolen konfokaalisen laserendomikroskopian (CLE) ensisijaisena menetelmänä. diagnostinen menettely potilailla, joilla epäillään aGI-GvHD:tä hematopoieettisen kantasolusiirron (HSCT) jälkeen.

• Tutkijat pyrkivät tutkimaan, voidaanko aGI-GvHD:n varhainen diagnoosi pohjukaissuolessa ja jejunumissa saavuttaa arvioimalla endomikroskooppisia ominaisuuksia.
• Verrattuna tavanomaisiin biopsioihin mainituista GI-osista kultastandardina tutkijat haluavat testata, ovatko Bojarskin et al. kuvaamat markkerit. kaksoispiste pätee myös ohutsuoleen.
• Mukaan lukien endomikroskooppiset tulokset keliakiasta, enteraalisista infektioista, tulehduksellisista suolistosairaudista ja terveistä koehenkilöistä verrokkeina, tutkijat pyrkivät muodostamaan spesifisiä aGI-GvHD-markkereita, joita voidaan käyttää "biopsiattoman" aGI-GvHD:n in vivo -diagnoosissa.

Opintojen suunnittelu

Prospektiivinen kliininen pilottitutkimus ilman satunnaistamista tai sokkoutumista

Tutkimusväestö

Hematopoieettisen kantasolusiirron (HSCT) jälkeiset potilaat, jotka lähetetään tutkimuspaikalle selvittämään jokin seuraavista oireista:

• anoreksia
• pahoinvointi
• oksentelua
• vatsakipu
• ripuli
• suoliston verenvuoto

Hoitohoidon mahdollisten sivuvaikutusten sulkemiseksi pois GI-oireiden on täytynyt ilmaantua tai jatkua 20 päivää vastaavan elinsiirtopäivän jälkeen [22].

Poissulkemiskriteerit:

• CMV- tai HSV-infektio
• ruoansulatuskanavan bakteeri-infektio
• lääkitykseen liittyviä oireita
• potilaat, jotka ovat allergisia jollekin lääkkeen aineosista (mukaan lukien tietoiseen sedaatioon käytetyt lääkkeet, kuten propofoli tai midatsolaami, sekä fluoreseiini, CLE:ssä käytettävä fluoresoiva väriaine)
• kieltäytyminen osallistumasta tutkimukseen
• potilaan ikä alle 18 vuotta.

menetelmät

Tämä tutkimus suoritetaan Wienin lääketieteellisen yliopiston sisätautien osastolla III, gastroenterologian ja hepatologian osastolla. Potilaiden rekrytointi toteutetaan tiiviissä yhteistyössä sisätautien klinikka I:n syöpätautien osaston luuydintransplantaatioyksikön kanssa.

Koska tämä tutkimus on suunniteltu pilottitutkimukseksi, se keskittyy pääasiassa ohutsuolen kvalitatiivisiin endomikroskooppisiin piirteisiin GvHD-potilailla, jotta saataisiin vertailupatologioita tarkkaa diagnoosia varten tulevaisuudessa. Siitä huolimatta kvantitatiivinen analyysi suoritetaan vertaamalla CLE-peräisiä diagnooseja histologisiin tuloksiin CLE-pohjaisen aGI-GvHD-diagnoosin herkkyyden ja spesifisyyden laskemiseksi ohutsuolessa. Ottaen huomioon nykyisen 62 %:n diagnostisen tuoton aGI-GvHD:n havaitsemiseksi oireellisilla post-HSCT-potilailla tavanomaisen histologian avulla [19], tutkijat arvioivat ottavan mukaan 40 potilasta, joilla epäillään aGI-GvHD:tä, jotta voidaan löytää mielekäs otos potilaista. aGI-GvHD vaikuttaa kvalitatiiviseen ja kvantitatiiviseen analyysiin. Vertailun vuoksi Bojarski ym. sisälsi 35 potilasta, joista 19 lopulta kärsi aGI-GvHD:stä tavanomaisen histologian mukaan. He pystyivät sitten laskemaan 74 %:n herkkyyden ja 100 %:n spesifisyyden histologisen diagnoosin ennustamiseksi CLE:n avulla [21]. HSCT:n jälkeisten potilaiden nykyisen esiintymistiheyden perusteella tutkimuspaikalla tutkijat arvioivat tavoitellun määrän 40 potilasta 2 vuoden aikana.

Kaikki potilaat, jotka täyttävät luetellut osallistumiskriteerit, saavat tämän tutkimuksen potilastietolomakkeen sekä tavanomaisen tietoon perustuvan suostumuslomakkeen vastaavasta endoskooppisesta tutkimuksesta, johon he ovat menossa. Potilastiedotus tehdään vähintään 24 tuntia ennen interventiota yksikössämme harjoitetulla tavalla. Jos potilas suostuu osallistumaan tutkimukseen, hänet valmistetaan endoskopiaan antamalla suonensisäisesti propofolia ja/tai midatsolaamia, joita käytetään rutiininomaisesti tietoiseen sedaatioon osastollamme endoskooppisten toimenpiteiden aikana. Lisäksi 5-10 ml 10-prosenttista fluoreseiininatriumliuosta annetaan suonensisäisesti kudoksen fluoresenssin tehostamiseksi endomikroskopian aikana. Koska erityistä CLE-enteroskooppia ei toistaiseksi ole saatavilla, käytämme CLE-kolonoskooppia (Pentax EC-3870 CIFK ISC-1000 konfokaalisen endomikroskopiaprosessorin kanssa - Pentax, Tokio, Japani ja Optiscan Pty Ltd, Notting Hill, Victoria, Australia) päästä ohutsuoleen, mikä on verrattavissa enteroskooppiseen toimenpiteeseen (suun pääsy).

Kaikki lääkkeet antavat erikoislääkärit, apulaislääkärit tai sairaanhoitajat, kuten laitoksessamme rutiininomaisesti käytetään.

CLE-kuvanotto alkaa jejunumin syvimmästä päästä. CLE-kuvat otetaan 10 senttimetrin välein ohutsuolesta, sen jälkeen mahalaukun antrumista ja rungosta sekä ruokatorvesta. Lisäksi CLE:tä käytetään erottuvan näköisille alueille, joilla on epäilys patologisesta alkuperästä. Aina kun CLE-kuvia saadaan, tavanomainen biopsia otetaan samasta sijainnista.

CLE-kuvat kaapataan ja tallennetaan rutiininomaisesti käyttämällä standardia tiedonhallintajärjestelmäämme. Heidät arvioidaan välittömästi endoskooppisen toimenpiteen jälkeen yhdessä lautakunnan sertifioidun GI-patologin kanssa, joka määrittää alustavan diagnoosin.

Tavanomaiset biopsiat värjätään hematoksyliinilla ja eosiinilla sekä PAS-värjäyksellä. In situ -hybridisaatio CMV:lle ja HSV:lle suoritetaan virusinfektion poissulkemiseksi. GvHD:n luokittelu tehdään McDonald and Salen mukaan neljään luokkaan, jotka on asianmukaisesti muokattu ohutsuolelle [23]:

• Aste I: yksittäisten solujen nekroosi
• Aste II: kryptaabsessi
• Grade III: putoaa pois yhdestä tai useammasta kokonaisesta kryptasta biopsiassa
• Aste IV: epiteelin täydellinen denudaatio

Endomikroskooppiset kontrollit (potilaat, joilla on keliakia, enteraaliset infektiot, tulehduksellinen suolistosairaus ja terveet koehenkilöt) kerätään nykyisistä tiedoista rutiinitutkimuksissa jo suoritetuista endomikroskooppisista toimenpiteistä.

Tutkimuksen lopussa kaikki CLE-kuvat ja histologiset leikkaukset arvioivat erikseen kaksi sokeaksi sertifioitua patologia. Jos diagnoosi on ristiriidassa, he analysoivat tapaukset yhdessä päästäkseen sopimukseen lopullisesta diagnoosista. Kaikki tapaukset, joissa alkuperäinen ja lopullinen diagnoosi poikkeavat toisistaan, arvioivat yhdessä uudelleen kaikki mukana olevat asiantuntijat.

Riski-hyötyarvio

GvHD on tärkein sairastuvuuden ja kuolleisuuden syy allogeenisen HSCT:n jälkeen. Noin 10–40 %:lle potilaista, joille tehdään HSCT, kehittyy merkittävä GvHD, ja noin puolet näistä potilaista kuolee tähän sairauteen tai hoidon aiheuttamiin komplikaatioihin [1].

Endoskooppiset toimenpiteet potilailla, joilla epäillään aGI-GvHD:tä, ovat vakiintuneet. Tähän asti GI-peräisten biopsioiden histologinen arviointi on kultainen standardi työkalu tarkan aGI-GvHD-diagnoosin asettamiseen. Ylemmän ruoansulatuskanavan endoskopia on mukavampaa kuin alemman ruoansulatuskanavan endoskopia, koska suolen valmistelua ei tarvita. Siksi se on ensisijainen tekniikka HSCT-potilaiden arvioimiseksi osastollamme. Tutkimuslaitoksen viimeaikaisten tulosten [19] tukemana nämä ylemmän maha-suolikanavan endoskopiat tehdään rutiininomaisesti enteroskoopiana gastroskopian sijasta ohutsuolen sisällyttämiseksi diagnostiseen arviointiin. Enteroskopian turvallisuutta ei ole tutkittu systemaattisesti, mutta raportoitu kokemus on huomattava ja komplikaatiot ovat olleet harvinaisia ​​[24].

Konfokaalinen laserendomikroskopia on turvallinen uusi tekniikka, jota on jo tutkittu kliinisissä tutkimuksissa [25, 26]. Sen turvallisuus taataan käyttämällä matalan intensiteetin laservaloa, joka voi pahimmillaan aiheuttaa fluoreseiinia sisältävien solujen paikallista valkaisua, joka on vaaratonta, palautuvaa ja jopa diagnostisena merkkinä koeolosuhteissa [20].

Eettiset vaikutukset

Tämän tutkimusprotokollan hyväksyi Wienin lääketieteellisen yliopiston eettinen toimikunta.

Kaikki tähän tutkimukseen liittyvät toimenpiteet suoritetaan Helsingin julistuksen sekä Wienin lääketieteellisen yliopiston hyvän tieteellisen käytännön (GSP) ohjeiden mukaisesti.

Odotettu vaikutus ja näkymät

Jos tutkijat löytävät aGI-GvHD-spesifisiä markkereita, joita voidaan käyttää "biopsiattoman" aGI-GvHD:n in vivo -diagnoosin tekemiseen, tämä voi johtaa invasiivisten toimenpiteiden vähentämiseen potilailla HSCT:n jälkeen. Tällä olisi suuri kliininen vaikutus, koska biopsian arviointia rajoittaa usein tämän potilasryhmän huono hyytymistila.

Jos he eivät pysty selkeästi määrittämään spesifisiä aGI-GvHD-markkereita, CLE:n tulisi ainakin vähentää diagnoosiin tarvittavien tavanomaisten biopsioiden määrää ottamalla ne CLE:n ohjauksessa.

Huolimatta odotetusta invasiivisten toimenpiteiden vähenemisestä, aGI-GvHD-diagnoosi in vivo voi johtaa immunosuppressiivisen hoidon välittömään aloittamiseen taudin etenemisen ja leviämisen vähentämiseksi.

Mikäli tämän pilottitutkimuksen tulokset tukevat tutkimuksen tavoitteita, suoritetaan satunnaistettu kontrolloitu tutkimus, jossa verrataan in vivo -diagnoosia tavanomaiseen histologiseen arviointiin sairaalahoitoon ja eloonjäämiseen liittyvissä asioissa.