Endomicroscopia e malattia del trapianto contro l'ospite

La malattia del trapianto contro l'ospite (GvHD) rappresenta una delle principali cause di morbilità e mortalità nei pazienti sottoposti a trapianto di cellule staminali emopoietiche (HSCT) [1]. Nel tratto gastrointestinale come uno dei principali organi bersaglio della diagnosi di GvHD può essere difficile a causa di molte diagnosi differenziali simili che presentano, la più notevole, infezioni da citomegalovirus [2]. Gli esperti non sono d'accordo sul miglior approccio diagnostico per i pazienti sospettati di GvHD gastrointestinale acuta (aGI-GvHD). Ci sono stati molti studi a sostegno della valutazione endoscopica della parte inferiore [3, 4, 5], superiore [6, 7] o di entrambe le parti del tratto gastrointestinale [8, 9]. In entrambi i casi, la valutazione istologica dei campioni bioptici serve come strumento standard per stabilire la diagnosi finale [10].

Considerando le condizioni generali piuttosto cattive dei pazienti dopo HSCT come un fattore limitante per la valutazione endoscopica e istologica, alcuni nuovi approcci sono stati introdotti nel manuale diagnostico di aGI-GvHD al fine di ridurre la quantità di esami invasivi. Tecniche di imaging convenzionali come la risonanza magnetica [11], la tomografia computerizzata [12] e l'ecografia ad alta risoluzione con Doppler Imaging [13] hanno riportato l'ispessimento della parete intestinale nei pazienti con GvHD. Ma poiché tali risultati sono solo segni non specifici di patologia gastrointestinale, le tecniche di imaging convenzionali non possono sostituire l'endoscopia con le biopsie [14]. Lo stesso vale per l'endoscopia della capsula video che è stata effettivamente trovata avere un alto valore predittivo negativo per il rilevamento di aGI-GvHD, ma condivide l'importante difetto di campioni bioptici mancanti per la valutazione istologica [15, 16, 17].

Almeno questo metodo ha spostato il centro dell'interesse sull'intestino tenue. Le biopsie derivanti da questa ex parte gastrointestinale trascurata avevano mostrato un'elevata sensibilità per i cambiamenti correlati alla GvHD in studi precedenti [18]. Poiché risultati simili sono stati osservati nel sito dello studio, i ricercatori hanno confrontato in modo prospettico l'enteroscopia con le biopsie con l'attuale gold standard nella gestione diagnostica dell'aGI-GvHD, la colonscopia con le biopsie. Nel contesto di questa indagine, l'intestino crasso ha mostrato un'affezione molto più forte da parte di aGI-GvHD rispetto a tutte le altre sedi, sebbene non ci fosse un paio di esami, in cui la colonscopia ha rivelato aGI-GvHD senza la presenza di tali risultati all'enteroscopia. Al contrario, l'enteroscopia ha persino rivelato patologie correlate alla GvHD in un caso in cui la rispettiva colonscopia è rimasta poco appariscente. Di conseguenza, hanno ipotizzato che i reperti enteroscopici possano sostituire la necessità della colonscopia [19], per cui i pazienti post-HSCT potrebbero rimanere senza una preparazione intestinale stressante, spesso limitata dalle loro condizioni generali piuttosto cattive.

Uno degli ultimi sviluppi nella gestione endoscopica del tratto gastrointestinale è il cosiddetto endomicroscopio laser confocale (CLE). La microscopia confocale è stata sviluppata da Marvin Minsky alla fine degli anni '50. Il suo principio è la scansione microscopica dei punti focali sotto la superficie di un oggetto. Rispetto alla microscopia ottica convenzionale utilizza uno speciale sistema di filtri per evitare la sovrapposizione dell'immagine da parte del tessuto circostante. In dettaglio, una sorgente luminosa (normalmente un laser) viene focalizzata da una lente dell'obiettivo del microscopio su un punto limitato dalla diffrazione sopra o all'interno dell'oggetto. La luce che viene diffusa, o la fluorescenza eccitata (ottenuta attraverso la colorazione con fluoresceina, per esempio) ed emessa, al fuoco nel campione ritornerà parzialmente indietro attraverso l'ottica lungo il percorso da cui è arrivata. Un divisore di raggio posto nel percorso riflette la luce di ritorno verso un rilevatore. L'ottica focalizzerà la luce dal punto focale nel campione al suo fuoco coniugato vicino al rivelatore (quindi la tecnologia è definita "confocale"). Qui viene utilizzato un filtro spaziale ("pinhole") per spegnere tutta la luce proveniente da aree esterne al punto focale. I riflessi di luce dal punto focale stesso saranno inoltrati al rivelatore che è collegato a un sistema informatico che digitalizza il segnale ottico e crea l'immagine istologica in vivo [20].

Concentrandosi sul suo impatto clinico, la microscopia confocale è la prima tecnica a consentire la valutazione in vivo delle strutture tissutali al di sotto della loro superficie. A causa di molte scoperte nella miniaturizzazione (principalmente negli anni '90) questa tecnologia potrebbe essere applicata per uso intraluminale in gastroenterologia, integrata in un endoscopio altrimenti standard. Consente la visualizzazione istologica in vivo dei 250 micrometri superiori di tutte le pareti all'interno del tratto gastrointestinale, in aggiunta alla normale funzione dell'endoscopia a luce bianca (fornita da due schermi separati sopra la postazione di lavoro) [20].

Il primo uso clinico di CLE in uno studio pilota prospettico che includeva 35 pazienti dopo HSCT è stato riportato da Bojarski et al. nel 2009. Il CLE della mucosa del colon potrebbe predire la diagnosi positiva di aGI-GvHD in 14 su 19 pazienti, successivamente confermata dalla valutazione istologica. I risultati in vivo di aGI-GvHD, che variavano dall'apoptosi di una singola cripta alla completa perdita di cripta, erano chiaramente distinguibili da patologie di altra origine come la colite infettiva o la colite ulcerosa, entrambe utilizzate come controllo comparativo [21].

Scopi dello studio

In questa indagine clinica i ricercatori intendono continuare l'approccio diagnostico per la malattia acuta del trapianto contro l'ospite gastrointestinale (aGI-GvHD). Sulla base dei recenti risultati presso l'istituto di studio (spiegato sopra, [19]) che hanno mostrato una notevole resa diagnostica per le patologie associate aGI-GvHD nell'intestino tenue, i ricercatori intendono valutare l'endomicroscopia laser confocale (CLE) dell'intestino tenue come primario procedura diagnostica in pazienti con sospetta aGI-GvHD dopo trapianto di cellule staminali emopoietiche (HSCT).

• Gli investigatori mirano a esaminare se la diagnosi precoce di aGI-GvHD nel duodeno e nel digiuno può essere raggiunta valutando le caratteristiche endomicroscopiche.
• Rispetto alle biopsie convenzionali delle parti GI menzionate come gold standard, i ricercatori vogliono verificare se i marcatori descritti da Bojarski et al. per il colon vale anche per l'intestino tenue.
• Includendo i risultati endomicroscopici di pazienti con malattia celiaca, infezioni enterali, malattia infiammatoria intestinale e soggetti sani come controlli, i ricercatori mirano a stabilire marcatori specifici aGI-GvHD che possano essere utilizzati per una diagnosi in vivo "senza biopsia" di aGI-GvHD.

Progettazione dello studio

Studio pilota clinico prospettico senza randomizzazione o accecamento

Popolazione di studio

Pazienti dopo trapianto di cellule staminali emopoietiche (HSCT) che vengono indirizzati al sito dello studio per chiarimenti su uno dei seguenti sintomi:

• anoressia
• nausea
• vomito
• dolore addominale
• diarrea
• sanguinamento intestinale

Per escludere possibili effetti collaterali della terapia di condizionamento, i sintomi gastrointestinali devono essersi verificati o persistere 20 giorni dopo la rispettiva data di trapianto [22].

Criteri di esclusione:

• infezione da CMV o HSV
• infezione batterica del tratto gastrointestinale
• sintomi correlati ai farmaci
• pazienti allergici a uno dei componenti del farmaco (compresi i farmaci usati per la sedazione cosciente come il propofol o il midazolam così come la fluoresceina, il colorante fluorescente usato per il CLE)
• rifiuto di partecipare allo studio
• età del paziente inferiore a 18 anni.

Metodi

Questa indagine sarà eseguita presso l'Università di Medicina di Vienna, Dipartimento di Medicina Interna III, Divisione di Gastroenterologia ed Epatologia. Il reclutamento dei pazienti avverrà in stretta collaborazione con il Dipartimento di Medicina Interna I, Divisione di Oncologia, Unità di Trapianto di Midollo Osseo.

Poiché questo studio è stato pianificato come sperimentazione pilota, si concentra principalmente sulle caratteristiche endomicroscopiche qualitative dell'intestino tenue nei pazienti con GvHD per fornire patologie di riferimento per una diagnosi accurata in futuro. Tuttavia, verrà eseguita un'analisi quantitativa confrontando le diagnosi derivate da CLE con i risultati istologici per calcolare la sensibilità e la specificità della diagnosi di aGI-GvHD basata su CLE nell'intestino tenue. Considerando l'attuale resa diagnostica del 62% per il rilevamento di aGI-GvHD in pazienti sintomatici post-HSCT mediante istologia convenzionale [19], i ricercatori hanno stimato di includere 40 pazienti con sospetta aGI-GvHD al fine di scoprire un campione significativo di pazienti affetti da aGI-GvHD per l'analisi qualitativa e quantitativa. In confronto, Bojarski et al hanno incluso 35 pazienti di cui 19 alla fine risultarono affetti da aGI-GvHD dall'istologia convenzionale. Hanno quindi potuto calcolare una sensibilità del 74% e una specificità del 100% per la previsione della diagnosi istologica mediante CLE [21]. Sulla base dell'attuale frequenza di pazienti post-HSCT presso il sito dello studio, i ricercatori stimano di includere la quantità prevista di 40 pazienti entro un periodo di tempo di 2 anni.

Tutti i pazienti che soddisfano i criteri di inclusione elencati riceveranno il modulo di informazione del paziente di questo studio insieme al consueto modulo di consenso informato del rispettivo esame endoscopico che stanno per sottoporsi. L'informazione del paziente verrà effettuata almeno 24 ore prima dell'intervento, come praticato presso la nostra unità. Se il paziente accetta di partecipare allo studio, sarà preparato per l'endoscopia mediante somministrazione di propofol e/o midazolam per via endovenosa come di routine utilizzato per la sedazione cosciente durante le procedure endoscopiche presso il nostro dipartimento. Inoltre, 5-10 ml di una soluzione al 10% di fluoresceina sodica saranno somministrati per via endovenosa per migliorare la fluorescenza dei tessuti durante l'endomicroscopia. Poiché finora non è disponibile un enteroscopio CLE specifico, utilizzeremo il colonscopio CLE (Pentax EC-3870 CIFK con il processore per endomicroscopia confocale ISC-1000 - Pentax, Tokyo, Giappone e Optiscan Pty Ltd, Notting Hill, Victoria, Australia) per raggiungere l'intestino tenue, paragonabile a una procedura enteroscopica (accesso orale).

Tutti i farmaci saranno somministrati da medici specialisti, assistenti medici o infermieri registrati, come praticato di routine presso il nostro istituto.

L'acquisizione delle immagini CLE inizierà nel punto più profondo raggiungibile nel digiuno. Durante il ritiro dell'endoscopio, le immagini CLE verranno eseguite ogni 10 centimetri nell'intestino tenue, quindi dall'antro e dal corpo dello stomaco e dall'esofago. Inoltre, il CLE verrà applicato per aree dall'aspetto distinto, sospette di origine patologica. Ovunque si ottengano immagini CLE, verrà prelevata una biopsia convenzionale dalla stessa localizzazione.

Le immagini CLE verranno acquisite e archiviate regolarmente utilizzando il nostro sistema di gestione dei dati standard. Saranno valutati immediatamente dopo la procedura endoscopica insieme a un patologo GI certificato dalla commissione, che stabilirà una diagnosi iniziale.

Le biopsie convenzionali saranno colorate con ematossilina ed eosina, così come con la colorazione PAS. L'ibridazione in situ per CMV e HSV sarà eseguita per escludere l'infezione virale. La classificazione della GvHD sarà effettuata secondo McDonald e Sale in 4 gradi, opportunamente modificati per l'intestino tenue [23]:

• Grado I: necrosi cellulare individuale
• Grado II: ascesso della cripta
• Grado III: abbandono di una o più cripte intere in una biopsia
• Grado IV: denudazione totale dell'epitelio

I controlli endomicroscopici (pazienti con malattia celiaca, infezioni enterali, malattia infiammatoria intestinale e soggetti sani) saranno raccolti dai dati attuali delle procedure endomicroscopiche già eseguite nell'ambito degli esami di routine.

Alla fine dello studio tutte le immagini CLE e i tagli istologici saranno valutati separatamente da due patologi certificati in cieco. In caso di diagnosi discordanti analizzeranno insieme i rispettivi casi per raggiungere un accordo sulla diagnosi finale. Tutti i casi in cui la diagnosi iniziale e quella finale si discostano l'una dall'altra saranno rivalutati insieme da tutti gli specialisti coinvolti.

Valutazione rischi/benefici

GvHD rappresenta una delle principali cause di morbilità e mortalità dopo HSCT allogenico. Circa il 10-40% dei pazienti sottoposti a HSCT sviluppa una GvHD significativa e circa la metà di questi pazienti muore a causa di questa malattia o delle complicanze derivanti dalla terapia [1].

Le procedure endoscopiche nei pazienti con sospetta aGI-GvHD sono ben consolidate. Fino ad ora la valutazione istologica delle biopsie derivanti da GI è lo strumento gold standard per impostare una diagnosi accurata di aGI-GvHD. L'endoscopia del tratto gastrointestinale superiore è più comoda della valutazione endoscopica del tratto gastrointestinale inferiore in quanto non è necessaria la preparazione intestinale. Pertanto è la tecnica principale per valutare i pazienti post-trapianto presso il nostro dipartimento. Supportate da recenti risultati presso l'istituto di studio [19], queste endoscopie del tratto gastrointestinale superiore vengono abitualmente eseguite come enteroscopie invece che come gastroscopie per includere l'intestino tenue nella valutazione diagnostica. La sicurezza dell'enteroscopia non è stata studiata in modo sistematico, ma l'esperienza riportata è sostanziale e le complicanze sono state rare [24].

L'endomicroscopia laser confocale è una nuova tecnica sicura che è già stata studiata in studi clinici [25, 26]. La sua sicurezza è garantita dall'uso di luce laser a bassa intensità che può nel peggiore dei casi causare lo sbiancamento locale delle cellule contenenti fluoresceina, che è innocuo, reversibile e persino utilizzato come segno diagnostico in condizioni sperimentali [20].

Implicazioni etiche

Questo protocollo di studio è stato approvato dalla commissione etica dell'Università di Medicina di Vienna.

Tutte le procedure nel contesto di questo studio saranno eseguite in conformità alla Dichiarazione di Helsinki e alle linee guida per la buona pratica scientifica (GSP) dell'Università di medicina di Vienna.

Impatto previsto e prospettive

Se i ricercatori trovano marcatori specifici aGI-GvHD che possono essere utilizzati per una diagnosi in vivo "senza biopsia" di aGI-GvHD, ciò potrebbe portare a un'altra riduzione delle procedure invasive per i pazienti dopo l'HSCT. Ciò avrebbe un grande impatto clinico, poiché la valutazione della biopsia è spesso limitata dal cattivo stato di coagulazione di questo gruppo di pazienti.

Nel caso in cui non siano in grado di determinare chiaramente marcatori specifici di aGI-GvHD, il CLE dovrebbe almeno ridurre la quantità di biopsie convenzionali necessarie per la diagnosi prendendole sotto la guida del CLE.

Nonostante la prevista riduzione delle procedure invasive, la diagnosi di aGI-GvHD in vivo potrebbe portare all'inizio immediato del trattamento immunosoppressivo al fine di ridurre la progressione e la diffusione della malattia.

Nel caso in cui gli obiettivi dello studio saranno supportati dai risultati di questo studio pilota, verrà eseguito uno studio controllato randomizzato che confronta la diagnosi in vivo con la valutazione istologica convenzionale in materia di ospedalizzazione e sopravvivenza.