Endomicroscopie en graft-versus-host-ziekte

Graft-versus-host-ziekte (GvHD) vertegenwoordigt een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij patiënten die een hematopoëtische stamceltransplantatie (HSCT) hebben ondergaan [1]. In het maagdarmkanaal, als een van de belangrijkste doelorganen van GvHD, kan de diagnose moeilijk zijn vanwege veel vergelijkbare differentiële diagnoses, met als meest opvallende infecties door het cytomegalovirus [2]. Deskundigen zijn het oneens over de beste diagnostische aanpak voor patiënten die verdacht worden van acute gastro-intestinale GvHD (aGI-GvHD). Er zijn veel onderzoeken geweest die de endoscopische evaluatie van ofwel de onderste [3, 4, 5], de bovenste [6, 7] of beide delen van het maagdarmkanaal ondersteunen [8, 9]. In beide gevallen dient de histologische evaluatie van biopsiemonsters als standaardhulpmiddel om de definitieve diagnose vast te stellen [10].

Gezien de nogal slechte algemene toestand van patiënten na HSCT als een beperkende factor voor endoscopische en histologische evaluatie, zijn er enkele nieuwe benaderingen geïntroduceerd in de diagnostische handleiding van aGI-GvHD om het aantal invasieve onderzoeken te verminderen. Conventionele beeldvormingstechnieken zoals magnetische resonantie beeldvorming [11], computertomografie [12] en hoge-resolutie echografie met Doppler Imaging [13] rapporteerden darmwandverdikking bij GvHD-patiënten. Maar aangezien dergelijke bevindingen slechts niet-specifieke tekenen zijn van gastro-intestinale pathologie, kunnen conventionele beeldvormende technieken endoscopie niet vervangen door biopsieën [14]. Hetzelfde geldt voor videocapsule-endoscopie die inderdaad een hoge negatief voorspellende waarde bleek te hebben voor de detectie van aGI-GvHD, maar deelt de belangrijke tekortkoming van ontbrekende biopsiemonsters voor histologische evaluatie [15, 16, 17].

Deze methode verlegde in ieder geval de aandacht voor de dunne darm. Biopsieën afkomstig van dit voormalige verwaarloosde GI-deel hadden in eerdere studies een hoge gevoeligheid voor GvHD-gerelateerde veranderingen aangetoond [18]. Aangezien vergelijkbare resultaten werden gezien op de onderzoekslocatie, vergeleken de onderzoekers enteroscopie met biopsieën prospectief met de huidige gouden standaard in de diagnostische aGI-GvHD-behandeling, colonoscopie met biopsieën. In de context van dit onderzoek vertoonde de dikke darm een ​​veel sterkere aantasting door aGI-GvHD dan alle andere locaties, hoewel er geen twee onderzoeken waren waarbij colonoscopie aGI-GvHD aan het licht bracht zonder de aanwezigheid van dergelijke bevindingen bij enteroscopie. Integendeel, enteroscopie onthulde zelfs GvHD-gerelateerde pathologieën in één geval waar de respectieve colonoscopie onopvallend bleef. Bijgevolg postuleerden ze dat enteroscopische bevindingen de noodzaak van colonoscopie zouden kunnen vervangen [19], waardoor post-HSCT-patiënten zonder stressvolle darmvoorbereiding zouden kunnen blijven, vaak beperkt door hun nogal slechte algemene toestand.

Een van de nieuwste ontwikkelingen in de endoscopische behandeling van het maagdarmkanaal is de zogenaamde confocale laser-endomicroscoop (CLE). Confocale microscopie is eind jaren vijftig ontwikkeld door Marvin Minsky. Het principe is het microscopisch scannen van brandpunten onder het oppervlak van een object. In vergelijking met conventionele lichtmicroscopie gebruikt het een speciaal filtersysteem om beeldoverlapping door omringend weefsel te voorkomen. In detail wordt een lichtbron (normaal gesproken een laser) door een microscoopobjectief gefocusseerd op een diffractiebeperkte plek op of in het object. Licht dat wordt verstrooid of door fluorescentie wordt geëxciteerd (bijvoorbeeld verkregen door fluoresceïnekleuring) en uitgezonden, bij de focus in het monster, zal gedeeltelijk terugkeren door de optica langs het pad waar het vandaan kwam. Een bundelsplitser die in het pad is geplaatst, reflecteert het retourlicht naar een detector. De optiek focust het licht van het brandpunt in het preparaat naar zijn geconjugeerde focus nabij de detector (vandaar wordt de technologie "con-focaal" genoemd). Hier wordt een ruimtelijk filter ("pinhole") gebruikt om al het licht te doven dat afkomstig is van gebieden buiten het brandpunt. Lichtreflecties van het brandpunt zelf worden doorgestuurd naar de detector die is aangesloten op een computersysteem dat het optische signaal digitaliseert en het in vivo histologische beeld creëert [20].

Confocale microscopie, gericht op de klinische impact, is de eerste techniek die in vivo evaluatie van weefselstructuren onder hun oppervlak mogelijk maakt. Vanwege de vele doorbraken op het gebied van miniaturisatie (voornamelijk in de jaren negentig) kon deze technologie worden toegepast voor intraluminaal gebruik in de gastro-enterologie, geïntegreerd in een overigens standaard endoscoop. Het maakt de in vivo histologische visualisatie mogelijk van de bovenste 250 micrometer van alle wanden in het maagdarmkanaal, naast de normale functie van endoscopie met wit licht (geleverd door twee afzonderlijke schermen bovenop het werkstation) [20].

Het eerste klinische gebruik van CLE in een prospectieve pilotstudie met 35 patiënten na HSCT werd gemeld door Bojarski et al. in 2009. CLE van het colonslijmvlies kon de positieve diagnose van aGI-GvHD voorspellen bij 14 van de 19 patiënten, later bevestigd door histologische evaluatie. De in vivo bevindingen van aGI-GvHD, variërend van apoptose van een enkele crypte tot volledig verlies van de crypte, waren duidelijk te onderscheiden van pathologieën van andere oorsprong zoals infectieuze colitis of colitis ulcerosa, beide gebruikt als vergelijkende controle [21].

Doelen bestuderen

In dit klinische onderzoek zijn de onderzoekers van plan de diagnostische aanpak voor acute gastro-intestinale graft-versus-hostziekte (aGI-GvHD) voort te zetten. Op basis van de recente resultaten bij de studie-instelling (hierboven uitgelegd, [19]) die een opmerkelijke diagnostische opbrengst lieten zien voor aGI-GvHD-geassocieerde pathologieën in de dunne darm, zijn de onderzoekers van plan om confocale laser-endomicroscopie (CLE) van de dunne darm als primair onderzoek te evalueren. diagnostische procedure bij patiënten met verdenking op aGI-GvHD na hematopoëtische stamceltransplantatie (HSCT).

• De onderzoekers willen onderzoeken of een vroege diagnose van aGI-GvHD in de twaalfvingerige darm en het jejunum kan worden bereikt door endomicroscopische kenmerken te evalueren.
• In vergelijking met conventionele biopten van de genoemde GI-delen als gouden standaard willen de onderzoekers testen of de door Bojarski et al. voor de dikke darm geldt ook voor de dunne darm.
• Met inbegrip van endomicroscopische resultaten van patiënten met coeliakie, enterale infecties, inflammatoire darmaandoeningen en gezonde proefpersonen als controles, streven de onderzoekers ernaar aGI-GvHD-specifieke markers vast te stellen die kunnen worden gebruikt voor een "biopsievrije" in vivo diagnose van aGI-GvHD.

Ontwerp ontwerpen

Prospectieve klinische pilotstudie zonder randomisatie of blindering

Studie Bevolking

Patiënten na hematopoëtische stamceltransplantatie (HSCT) die naar de onderzoekslocatie zijn verwezen voor opheldering van een van de volgende symptomen:

• anorexia
• misselijkheid
• braken
• buikpijn
• diarree
• darmbloeding

Om mogelijke bijwerkingen van de conditioneringstherapie uit te sluiten, moeten gastro-intestinale symptomen 20 dagen na de respectieve transplantatiedatum zijn opgetreden of aanhouden [22].

Uitsluitingscriteria:

• infectie met CMV of HSV
• bacteriële infectie van het maagdarmkanaal
• medicatie gerelateerde klachten
• patiënten die allergisch zijn voor een van de geneesmiddelcomponenten (inclusief geneesmiddelen die worden gebruikt voor bewuste sedatie zoals propofol of midazolam, evenals fluoresceïne, de fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt voor CLE)
• weigering om deel te nemen aan het onderzoek
• leeftijd van de patiënt onder de 18 jaar.

methoden

Dit onderzoek zal worden uitgevoerd aan de Medische Universiteit van Wenen, Afdeling Interne Geneeskunde III, Afdeling Gastro-enterologie en Hepatologie. De werving van patiënten zal worden gerealiseerd in nauwe samenwerking met de Afdeling Interne Geneeskunde I, Afdeling Oncologie, Beenmergtransplantatie-eenheid.

Aangezien deze studie is gepland als een pilootstudie, richt ze zich voornamelijk op de kwalitatieve endomicroscopische kenmerken van de dunne darm bij GvHD-patiënten om referentiepathologieën op te leveren voor een nauwkeurige diagnose in de toekomst. Desalniettemin zal een kwantitatieve analyse worden uitgevoerd door CLE-afgeleide diagnoses te vergelijken met histologische resultaten om de sensitiviteit en specificiteit van CLE-gebaseerde aGI-GvHD-diagnose in de dunne darm te berekenen. Gezien de huidige diagnostische opbrengst van 62% voor de detectie van aGI-GvHD bij symptomatische post-HSCT-patiënten door conventionele histologie [19], schatten de onderzoekers dat ze 40 patiënten met vermoedelijke aGI-GvHD includeerden om een ​​zinvolle steekproef van patiënten te ontdekken. beïnvloed door aGI-GvHD voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse. Ter vergelijking: Bojarski et al includeerden 35 patiënten van wie er uiteindelijk 19 bleken te lijden aan aGI-GvHD volgens conventionele histologie. Ze konden dan een sensitiviteit van 74% en een specificiteit van 100% berekenen voor de voorspelling van de histologische diagnose door CLE [21]. Op basis van de huidige frequentie van post-HSCT-patiënten op de onderzoekslocatie schatten de onderzoekers het beoogde aantal van 40 patiënten binnen een tijdsperiode van 2 jaar.

Alle patiënten die aan de vermelde inclusiecriteria voldoen, ontvangen het patiënteninformatieformulier van deze studie samen met het gebruikelijke formulier voor geïnformeerde toestemming van het respectieve endoscopische onderzoek dat ze op het punt staan ​​te ondergaan. Patiëntenvoorlichting vindt minimaal 24 uur voor de ingreep plaats, zoals op onze afdeling gebruikelijk is. Als de patiënt ermee instemt om aan het onderzoek deel te nemen, wordt hij/zij voorbereid op endoscopie door toediening van intraveneus propofol en/of midazolam, zoals routinematig gebruikt voor bewuste sedatie tijdens endoscopische procedures op onze afdeling. Bovendien zal 5-10 ml van een 10%-oplossing van fluoresceïne-natrium intraveneus worden toegediend om weefselfluorescentie tijdens endomicroscopie te versterken. Aangezien er tot nu toe geen specifieke CLE-enteroscoop beschikbaar is, gebruiken we de CLE-colonoscoop (Pentax EC-3870 CIFK met de ISC-1000 confocale endomicroscopieprocessor - Pentax, Tokyo, Japan en Optiscan Pty Ltd, Notting Hill, Victoria, Australië) om de dunne darm te bereiken, vergelijkbaar met een enteroscopische procedure (orale toegang).

Alle medicijnen worden toegediend door medisch specialisten, arts-assistenten of gediplomeerd verpleegkundigen, zoals dat in onze instelling gebruikelijk is.

Het vastleggen van CLE-foto's begint op het diepst bereikbare punt in het jejunum. Tijdens het terugtrekken van de scoop worden om de 10 centimeter CLE-foto's gemaakt in de dunne darm, vervolgens van het antrum en het lichaam van de maag en van de slokdarm. Bovendien zal CLE worden toegepast voor gebieden die er duidelijk uitzien, verdacht van pathologische oorsprong. Overal waar CLE-foto's worden gemaakt, wordt een conventionele biopsie genomen van dezelfde lokalisatie.

CLE-foto's worden routinematig vastgelegd en opgeslagen met behulp van ons standaard gegevensbeheersysteem. Ze worden onmiddellijk na de endoscopische procedure geëvalueerd samen met een gecertificeerde GI-patholoog, die een eerste diagnose zal stellen.

Conventionele biopsieën worden gekleurd met hematoxyline en eosine, evenals PAS-kleuring. In-situ hybridisatie voor CMV en HSV zal worden uitgevoerd om virale infectie uit te sluiten. Classificatie van GvHD zal worden gedaan volgens McDonald en Sale in 4 klassen, passend aangepast voor de dunne darm [23]:

• Graad I: individuele celnecrose
• Graad II: crypte abces
• Graad III: drop-out van een of meer hele crypten in een biopsie
• Graad IV: totale denudatie van epitheel

Endomicroscopische controles (patiënten met coeliakie, enterale infecties, inflammatoire darmaandoeningen en gezonde proefpersonen) zullen worden verzameld uit de huidige gegevens van endomicroscopische procedures die al zijn uitgevoerd in het kader van routineonderzoeken.

Aan het einde van het onderzoek zullen alle CLE-foto's en histologische coupes afzonderlijk worden beoordeeld door twee geblindeerde board-gecertificeerde pathologen. In het geval van tegenstrijdige diagnoses zullen zij de respectievelijke gevallen samen analyseren om tot overeenstemming te komen over de definitieve diagnose. Alle gevallen waarbij de begin- en einddiagnose van elkaar afwijken, worden gezamenlijk door alle betrokken specialisten opnieuw beoordeeld.

Risico-/batenanalyse

GvHD vertegenwoordigt een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit na allogene HSCT. Ongeveer 10-40% van de patiënten die HSCT ondergaan, ontwikkelen significante GvHD, en ongeveer de helft van deze patiënten overlijdt aan deze ziekte of aan therapiegerelateerde complicaties [1].

Endoscopische procedures bij patiënten met verdenking op aGI-GvHD zijn goed ingeburgerd. Tot nu toe is de histologische evaluatie van GI-afgeleide biopsieën de gouden standaard om een ​​nauwkeurige aGI-GvHD-diagnose te stellen. Endoscopie van het bovenste deel van het maagdarmkanaal is comfortabeler dan de endoscopische beoordeling van het onderste deel van het maagdarmkanaal, omdat er geen darmvoorbereiding nodig is. Daarom is het de primaire techniek om post-HSCT-patiënten op onze afdeling te beoordelen. Ondersteund door recente resultaten bij de studie-instelling [19] worden deze gastro-intestinale endoscopieën routinematig uitgevoerd als enteroscopieën in plaats van gastroscopieën om de dunne darm mee te nemen in de diagnostische evaluatie. De veiligheid van enteroscopie is niet systematisch onderzocht, maar de gerapporteerde ervaring is aanzienlijk en complicaties zijn zeldzaam [24].

Confocale laserendomicroscopie is een veilige nieuwe techniek die al in klinische onderzoeken is onderzocht [25, 26]. De veiligheid ervan wordt gegarandeerd door het gebruik van laserlicht met lage intensiteit dat in het slechtste geval lokale bleking van fluoresceïne-bevattende cellen kan veroorzaken, wat onschadelijk, omkeerbaar is en zelfs wordt gebruikt als diagnostisch teken in experimentele omstandigheden [20].

Ethische implicaties

Dit studieprotocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Medische Universiteit van Wenen.

Alle procedures in het kader van deze studie zullen worden uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en de richtlijnen voor goede wetenschappelijke praktijken (GSP) van de Medische Universiteit van Wenen.

Verwachte impact en vooruitzichten

Als de onderzoekers aGI-GvHD-specifieke markers vinden die kunnen worden gebruikt voor een "biopsievrije" in vivo diagnose van aGI-GvHD, zou dit kunnen leiden tot een verdere vermindering van invasieve procedures voor patiënten na HSCT. Dit zou een grote klinische impact hebben, aangezien biopsiebeoordeling vaak wordt beperkt door de slechte stollingsstatus van deze patiëntengroep.

In het geval dat ze specifieke markers van aGI-GvHD niet duidelijk kunnen bepalen, zou CLE op zijn minst de hoeveelheid conventionele biopsieën die nodig zijn voor diagnose moeten verminderen door ze onder CLE-begeleiding te nemen.

Ondanks de verwachte vermindering van invasieve procedures, zou aGI-GvHD-diagnose in vivo kunnen leiden tot onmiddellijke start van immunosuppressieve behandeling om progressie en verspreiding van de ziekte op de plaats te verminderen.

Indien de onderzoeksdoelstellingen worden ondersteund door de resultaten van deze proefstudie, zal een gerandomiseerde gecontroleerde studie worden uitgevoerd waarin in vivo diagnose wordt vergeleken met conventionele histologische beoordeling op het gebied van ziekenhuisopname en overleving.