Endomikroskopi og graft-versus-host-sykdom

Graft-versus-host-sykdom (GvHD) representerer en hovedårsak til sykelighet og dødelighet hos pasienter som gjennomgikk hematopoetisk stamcelletransplantasjon (HSCT) [1]. I mage-tarmkanalen som et av hovedmålorganene for GvHD-diagnose kan det være vanskelig på grunn av mange lignende differensialdiagnoser, mest bemerkelsesverdige infeksjoner av cytomegalovirus [2]. Eksperter er uenige om den beste diagnostiske tilnærmingen for pasienter som mistenkes for akutt gastrointestinal GvHD (aGI-GvHD). Det har vært mange studier som støtter endoskopisk evaluering av enten nedre [3, 4, 5], øvre [6, 7] eller begge deler av GI-kanalen [8, 9]. I begge tilfeller fungerer den histologiske evalueringen av biopsiprøver som standardverktøy for å etablere den endelige diagnosen [10].

Tatt i betraktning den ganske dårlige allmenntilstanden til pasienter etter HSCT som en begrensende faktor for endoskopisk og histologisk evaluering, har noen nye tilnærminger blitt introdusert i diagnosemanualen til aGI-GvHD for å redusere mengden invasive undersøkelser. Konvensjonelle bildeteknikker som magnetisk resonansavbildning [11], datatomografi [12] og høyoppløselig ultralyd med Doppler Imaging [13] rapporterte fortykning av tarmveggen hos GvHD-pasienter. Men siden slike funn kun er uspesifikke tegn på gastrointestinal patologi, kan ikke konvensjonelle bildeteknikker erstatte endoskopi med biopsier [14]. Det samme gjelder for videokapselendoskopi som faktisk ble funnet å ha en høy negativ prediktiv verdi for påvisning av aGI-GvHD, men deler den viktige mangelen med manglende biopsiprøver for histologisk evaluering [15, 16, 17].

I det minste flyttet denne metoden fokuset av interesse til tynntarmen. Biopsier avledet fra denne tidligere forsømte GI-delen hadde vist høy sensitivitet for GvHD-relaterte endringer i tidligere studier [18]. Ettersom lignende resultater ble sett på studiestedet, sammenlignet etterforskerne prospektivt enteroskopi med biopsier med dagens gullstandard i diagnostisk aGI-GvHD-behandling, koloskopi med biopsier. I sammenheng med denne undersøkelsen viste tykktarmen mye sterkere affeksjon av aGI-GvHD enn alle andre steder, selv om det ikke var noen par undersøkelser, der koloskopi avslørte aGI-GvHD uten tilstedeværelse av slike funn ved enteroskopi. Tvert imot avslørte enteroskopi til og med GvHD-relaterte patologier i ett tilfelle der den respektive koloskopien forble upåfallende. Følgelig postulerte de at enteroskopiske funn kan erstatte behovet for koloskopi [19], hvorfor post-HSCT-pasienter kunne forbli uten stressende tarmforberedelser, ofte begrenset av deres ganske dårlige allmenntilstand.

En av de siste utviklingene innen endoskopisk behandling av mage-tarmkanalen er det såkalte konfokale laserendomikroskopet (CLE). Konfokalmikroskopi ble utviklet av Marvin Minsky på slutten av 1950-tallet. Prinsippet er mikroskopisk skanning av fokuspunkter under overflaten til et objekt. Sammenlignet med konvensjonell lysmikroskopi bruker den et spesielt filtersystem for å unngå bildeoverlapping av omgivende vev. I detalj fokuseres en lyskilde (normalt en laser) av et mikroskopobjektiv til et diffraksjonsbegrenset punkt på eller inne i objektet. Lys som er spredt, eller fluorescens eksitert (oppnådd gjennom fluoresceinfarging, for eksempel) og sendt ut ved fokus i prøven vil delvis returnere tilbake gjennom optikken langs banen det kom fra. En stråledeler plassert i banen reflekterer returlyset mot en detektor. Optikken vil fokusere lyset fra fokuspunktet i prøven til dets konjugerte fokus nær detektoren (derfor kalles teknologien "konfokal"). Her brukes et romfilter ("pinhole") for å slukke alt lys som kommer fra områder utenfor brennpunktet. Lysrefleksjoner fra selve brennpunktet vil bli videresendt til detektoren som er koblet til et datasystem som digitaliserer det optiske signalet og skaper det in vivo histologiske bildet [20].

Med fokus på dens kliniske innvirkning, er konfokalmikroskopi den første teknikken for å tillate in vivo-evaluering av vevsstrukturer under overflaten. På grunn av mange gjennombrudd innen miniatyrisering (mest på 1990-tallet) kunne denne teknologien brukes for intraluminal bruk i gastroenterologi, integrert i et ellers standard endoskop. Den tillater in vivo histologisk visualisering av de øvre 250 mikrometer av alle vegger i mage-tarmkanalen, i tillegg til den normale funksjonen av hvitt lys endoskopi (tilveiebrakt av to separate skjermer på toppen av arbeidsstasjonen) [20].

Den første kliniske bruken av CLE i en prospektiv pilotstudie inkludert 35 pasienter etter HSCT ble rapportert av Bojarski et al. i 2009. CLE i tykktarmsslimhinnen kunne forutsi den positive diagnosen aGI-GvHD hos 14 av 19 pasienter, senere bekreftet ved histologisk evaluering. In vivo funnene av aGI-GvHD, varierende fra enkeltkryptapoptose til fullstendig kryptap, var tydelig å skille fra patologier av annen opprinnelse som infeksiøs kolitt eller ulcerøs kolitt, begge brukt som komparativ kontroll [21].

Studiemål

I denne kliniske undersøkelsen har etterforskerne til hensikt å fortsette den diagnostiske tilnærmingen for akutt gastrointestinal graft-versus-host-sykdom (aGI-GvHD). Basert på de nylige resultatene ved studieinstitusjonen (forklart ovenfor, [19]) som viste et bemerkelsesverdig diagnostisk utbytte for aGI-GvHD-assosierte patologier i tynntarmen, har etterforskerne til hensikt å evaluere konfokal laserendomikroskopi (CLE) av tynntarmen som primær diagnostisk prosedyre hos pasienter med mistanke om aGI-GvHD etter hematopoetisk stamcelletransplantasjon (HSCT).

• Etterforskerne tar sikte på å undersøke om tidlig diagnose av aGI-GvHD i tolvfingertarmen og jejunum kan oppnås ved å evaluere endomikroskopiske trekk.
• Sammenlignet med konvensjonelle biopsier fra de nevnte GI-delene som gullstandard ønsker etterforskerne å teste om markørene beskrevet av Bojarski et al. for tykktarmen gjelder også for tynntarmen.
• Inkludert endomikroskopiske resultater fra pasienter med cøliaki, enterale infeksjoner, inflammatorisk tarmsykdom og friske personer som kontroller, tar etterforskerne sikte på å etablere aGI-GvHD spesifikke markører som kan brukes for en "biopsifri" in vivo diagnose av aGI-GvHD.

Studere design

Prospektiv klinisk pilotstudie uten randomisering eller blinding

Studiepopulasjon

Pasienter etter hematopoetisk stamcelletransplantasjon (HSCT) som henvises til studiestedet for avklaring av ett av følgende symptomer:

• anoreksi
• kvalme
• oppkast
• magesmerter
• diaré
• intestinal blødning

For å utelukke mulige bivirkninger av kondisjoneringsterapien, må GI-symptomer ha oppstått eller vedvart 20 dager etter den respektive transplantasjonsdatoen [22].

Ekskluderingskriterier:

• infeksjon med CMV eller HSV
• bakteriell infeksjon i GI-kanalen
• medisinrelaterte symptomer
• pasienter som er allergiske mot en av legemiddelkomponentene (inkludert legemidler som brukes til bevisst sedasjon som propofol eller midazolam samt fluorescein, det fluorescerende fargestoffet som brukes for CLE)
• nektet å delta i studien
• pasientens alder under 18 år.

Metoder

Denne undersøkelsen vil bli utført ved det medisinske universitetet i Wien, Institutt for indremedisin III, avdeling for gastroenterologi og hepatologi. Pasientrekruttering vil skje i nært samarbeid med Institutt for indremedisin I, avdeling for onkologi, enhet for benmargstransplantasjon.

Siden denne studien er planlagt som et pilotforsøk, fokuserer den hovedsakelig på de kvalitative endomikroskopiske egenskapene til tynntarmen hos GvHD-pasienter for å gi referansepatologier for nøyaktig diagnose i fremtiden. Det vil likevel bli utført en kvantitativ analyse ved å sammenligne CLE-avledede diagnoser med histologiske resultater for å beregne sensitivitet og spesifisitet av CLE-basert aGI-GvHD diagnose i tynntarmen. Tatt i betraktning det nåværende diagnostiske utbyttet på 62 % for påvisning av aGI-GvHD hos symptomatiske post-HSCT-pasienter ved konvensjonell histologi [19], estimerte etterforskerne å inkludere 40 pasienter med mistenkt aGI-GvHD for å oppdage et meningsfullt utvalg av pasienter påvirket av aGI-GvHD for kvalitativ og kvantitativ analyse. Til sammenligning inkluderte Bojarski et al 35 pasienter, hvorav 19 til slutt viste seg å lide av aGI-GvHD ved konvensjonell histologi. De kunne deretter beregne en sensitivitet på 74 % og spesifisitet på 100 % for prediksjonen av den histologiske diagnosen ved CLE [21]. På grunnlag av den nåværende frekvensen av post-HSCT-pasienter på studiestedet anslår etterforskerne å inkludere den tilsiktede mengden på 40 pasienter innen en tidsperiode på 2 år.

Alle pasienter som oppfyller de oppførte inklusjonskriteriene, vil motta pasientinformasjonsskjemaet for denne studien sammen med det vanlige informerte samtykkeskjemaet for den respektive endoskopiske undersøkelsen de skal gjennomgå. Pasientinformasjon vil bli gjort minst 24 timer før intervensjonen, slik det praktiseres ved vår enhet. Dersom pasienten samtykker i å delta i studien vil han/hun forberedes for endoskopi ved administrering av intravenøs propofol og/eller midazolam som rutinemessig brukt til bevisst sedasjon under endoskopiske prosedyrer ved vår avdeling. I tillegg vil 5-10 ml av en 10 % løsning av fluoresceinnatrium bli administrert intravenøst ​​for å forbedre vevsfluorescens under endomikroskopi. Siden det så langt ikke er noe spesifikt CLE-enteroskop tilgjengelig, vil vi bruke CLE-koloskopet (Pentax EC-3870 CIFK med ISC-1000 konfokal endomikroskopiprosessor - Pentax, Tokyo, Japan og Optiscan Pty Ltd, Notting Hill, Victoria, Australia) å nå tynntarmen, sammenlignbar med en enteroskopisk prosedyre (oral tilgang).

Alle legemidler vil bli administrert av legespesialister, assistentleger eller registrerte sykepleiere, slik det rutinemessig praktiseres ved vår institusjon.

CLE-bildefangst vil starte på det dypeste punktet som kan nås i jejunum. Under tilbaketrekking av skopet vil CLE-bilder bli tatt hver 10. centimeter i tynntarmen, deretter fra antrum og magekropp og fra spiserøret. Videre vil CLE bli brukt for områder med tydelig utseende, mistenkelige for patologisk opprinnelse. Uansett hvor CLE-bilder er tatt, vil en konvensjonell biopsi bli tatt fra samme lokalisering.

CLE-bilder vil bli tatt og lagret rutinemessig ved hjelp av vårt standard databehandlingssystem. De vil bli evaluert umiddelbart etter den endoskopiske prosedyren sammen med en styresertifisert GI-patolog, som vil etablere en første diagnose.

Konvensjonelle biopsier vil bli farget med Haematoxylin & Eosin, samt PAS-farging. In situ hybridisering for CMV og HSV vil bli utført for å utelukke virusinfeksjon. Klassifisering av GvHD vil bli gjort i henhold til McDonald og Sale i 4 grader, passende modifisert for tynntarmen [23]:

• Grad I: individuell cellenekrose
• Grad II: kryptabscess
• Grad III: fall ut av en eller flere hele krypter i en biopsi
• Grad IV: total denudering av epitel

Endomikroskopiske kontroller (pasienter med cøliaki, enterale infeksjoner, inflammatorisk tarmsykdom og friske personer) vil bli samlet inn fra nåværende data om endomikroskopiske prosedyrer som allerede er utført innenfor rutineundersøkelser.

På slutten av studien vil alle CLE-bilder og histologiske kutt bli evaluert separat av to blindede sertifiserte patologer. Ved uoverensstemmende diagnoser vil de analysere de respektive tilfellene sammen for å komme til enighet om den endelige diagnosen. Alle tilfeller der den første og den endelige diagnosen avviker fra hverandre vil bli revurdert sammen av alle involverte spesialister.

Risiko/nyttevurdering

GvHD representerer en hovedårsak til sykelighet og dødelighet etter allogen HSCT. Omtrent 10-40 % av pasientene som gjennomgår HSCT utvikler signifikant GvHD, og ​​omtrent halvparten av disse pasientene dør av denne sykdommen eller av behandlingskomplikasjoner [1].

Endoskopiske prosedyrer hos pasienter med mistanke om aGI-GvHD er godt etablert. Til nå er den histologiske evalueringen av GI-avledede biopsier gullstandardverktøyet for å sette en nøyaktig aGI-GvHD-diagnose. Endoskopi av øvre GI-kanal er mer behagelig enn endoskopisk vurdering av nedre GI-kanal da det ikke er behov for tarmforberedelse. Derfor er det den primære teknikken for å vurdere post HSCT pasienter ved vår avdeling. Støttet av nylige resultater ved studieinstitusjonen [19] utføres disse øvre GI-endoskopiene rutinemessig som enteroskopier i stedet for gastroskopier for å inkludere tynntarmen i den diagnostiske evalueringen. Sikkerheten ved enteroskopi har ikke blitt studert systematisk, men rapportert erfaring er betydelig og komplikasjoner har vært sjeldne [24].

Konfokal laserendomikroskopi er en sikker ny teknikk som allerede er studert i kliniske studier [25, 26]. Sikkerheten blir garantert ved bruk av laserlys med lav intensitet som i verste fall kan forårsake lokal bleking av fluoresceinholdige celler, som er ufarlig, reversibel og til og med brukt som diagnostisk tegn under eksperimentelle forhold [20].

Etiske implikasjoner

Denne studieprotokollen ble godkjent av den etiske kommisjonen ved det medisinske universitetet i Wien.

Alle prosedyrer i sammenheng med denne studien vil bli utført i samsvar med Helsinki-erklæringen samt retningslinjene for god vitenskapelig praksis (GSP) fra det medisinske universitetet i Wien.

Forventet effekt og Outlook

Hvis etterforskerne finner aGI-GvHD-spesifikke markører som kan brukes for en "biopsifri" in vivo-diagnose av aGI-GvHD, kan dette føre til en ny reduksjon av invasive prosedyrer for pasienter etter HSCT. Dette vil ha stor klinisk effekt, da biopsivurdering ofte begrenses av den dårlige koagulasjonsstatusen til denne pasientgruppen.

I tilfelle de ikke klart kan bestemme spesifikke markører for aGI-GvHD, bør CLE i det minste redusere mengden konvensjonelle biopsier som trengs for diagnose ved å ta dem under CLE-veiledning.

Til tross for den forventede reduksjonen av invasive prosedyrer, kan aGI-GvHD-diagnose in vivo føre til umiddelbar oppstart av immunsuppressiv behandling for å redusere progresjon og spredning av sykdommen.

I tilfelle studiemålene vil bli støttet av resultatene fra denne pilotstudien, vil en randomisert kontrollert studie som sammenligner in vivo-diagnose med konvensjonell histologisk vurdering i spørsmål om sykehusinnleggelse og overlevelse bli utført.