Эндомикроскопия и реакция «трансплантат против хозяина»

Болезнь «трансплантат против хозяина» (РТПХ) представляет собой основную причину заболеваемости и смертности у пациентов, перенесших трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) [1]. В желудочно-кишечном тракте как одном из основных органов-мишеней РТПХ диагностика может быть затруднена из-за множества схожих дифференциальных диагнозов, наиболее заметными из которых являются инфекции цитомегаловирусом [2]. Эксперты расходятся во мнениях относительно наилучшего диагностического подхода для пациентов с подозрением на острую желудочно-кишечную РТПХ (оГИ-РТПХ). Было проведено много исследований, поддерживающих эндоскопическую оценку нижней [3, 4, 5], верхней [6, 7] или обеих частей желудочно-кишечного тракта [8, 9]. В любом случае гистологическая оценка образцов биопсии служит стандартным инструментом для установления окончательного диагноза [10].

Учитывая довольно тяжелое общее состояние пациентов после ТГСК как ограничивающий фактор для эндоскопической и гистологической оценки, в диагностическое руководство по аГИ-РТПХ были внесены новые подходы с целью сокращения объема инвазивных исследований. Обычные методы визуализации, такие как магнитно-резонансная томография [11], компьютерная томография [12] и ультразвуковое исследование высокого разрешения с допплеровской визуализацией [13], сообщали об утолщении стенки кишечника у пациентов с БТПХ. Но поскольку такие находки являются лишь неспецифическими признаками патологии желудочно-кишечного тракта, традиционные методы визуализации не могут заменить эндоскопию с биопсией [14]. То же самое относится и к видеокапсульной эндоскопии, которая действительно имеет высокую отрицательную прогностическую ценность для обнаружения aGI-GvHD, но разделяет важный недостаток отсутствия образцов биопсии для гистологической оценки [15, 16, 17].

По крайней мере, этот метод сместил фокус интереса на тонкую кишку. Биопсии, полученные из этой ранее запущенной части ЖКТ, показали высокую чувствительность к изменениям, связанным с БТПХ, в предыдущих исследованиях [18]. Поскольку аналогичные результаты были получены в исследовательском центре, исследователи проспективно сравнили энтероскопию с биопсией с нынешним золотым стандартом в диагностике aGI-GvHD, колоноскопией с биопсией. В контексте данного исследования толстая кишка демонстрировала гораздо более сильное поражение аЖКТ-РТПХ, чем все другие локализации, хотя не было ни одной пары обследований, при которых колоноскопия выявила бы аЖКТ-РТПХ без наличия таких находок при энтероскопии. Наоборот, энтероскопия даже выявила патологии, связанные с РТПХ, в одном случае, когда соответствующая колоноскопия осталась незаметной. Следовательно, они постулировали, что энтероскопические данные могут заменить необходимость колоноскопии [19], поэтому пациенты после ТГСК могут оставаться без стрессовой подготовки кишечника, часто ограниченной их довольно плохим общим состоянием.

Одной из последних разработок в области эндоскопического лечения желудочно-кишечного тракта является так называемый конфокальный лазерный эндомикроскоп (КЛЭ). Конфокальная микроскопия была разработана Марвином Мински в конце 1950-х годов. Его принцип заключается в микроскопическом сканировании фокальных точек под поверхностью объекта. По сравнению с обычной световой микроскопией в ней используется специальная система фильтров, позволяющая избежать перекрытия изображения окружающими тканями. В частности, источник света (обычно лазер) фокусируется линзой объектива микроскопа в ограниченную дифракцией точку на объекте или внутри него. Свет, рассеянный или возбужденный флуоресценцией (достигнутой, например, при окрашивании флуоресцеином) и испущенный в фокусе образца, частично вернется обратно через оптику по пути, с которого он пришел. Светоделитель, размещенный на пути, отражает отраженный свет к детектору. Оптика будет фокусировать свет от фокальной точки в образце к его сопряженному фокусу рядом с детектором (поэтому технология называется «конфокальной»). Здесь пространственный фильтр («отверстие») используется для подавления всего света, исходящего из областей за пределами фокуса. Световые отражения от самой фокальной точки будут направлены на детектор, который подключен к компьютерной системе, которая оцифровывает оптический сигнал и создает гистологическое изображение in vivo [20].

Сосредоточившись на своем клиническом влиянии, конфокальная микроскопия является первым методом, позволяющим оценивать in vivo структуры тканей под их поверхностью. Благодаря многочисленным прорывам в области миниатюризации (в основном в 1990-х годах) эту технологию можно было применять для внутрипросветного использования в гастроэнтерологии, интегрируя ее в стандартный эндоскоп. Это позволяет проводить гистологическую визуализацию in vivo верхних 250 микрометров всех стенок желудочно-кишечного тракта в дополнение к нормальной функции эндоскопии в белом свете (обеспечиваемой двумя отдельными экранами в верхней части рабочей станции) [20].

О первом клиническом применении CLE в проспективном пилотном исследовании, включавшем 35 пациентов после ТГСК, сообщили Bojarski et al. в 2009. CLE слизистой оболочки толстой кишки может предсказать положительный диагноз aGI-GvHD у 14 из 19 пациентов, позже подтвержденный гистологической оценкой. Находки aGI-GvHD in vivo, варьирующие от апоптоза единичных крипт до полной потери крипт, были четко отличимы от патологий другого происхождения, таких как инфекционный колит или язвенный колит, которые использовались в качестве сравнительного контроля [21].

Цели исследования

В этом клиническом исследовании исследователи намерены продолжить диагностический подход к острой желудочно-кишечной болезни «трансплантат против хозяина» (aGI-GvHD). Основываясь на недавних результатах в исследовательском учреждении (объяснено выше, [19]), которые показали замечательную диагностическую ценность для патологий тонкой кишки, связанных с aGI-GvHD, исследователи намерены оценить конфокальную лазерную эндомикроскопию (CLE) тонкой кишки как первичную. диагностическая процедура у пациентов с подозрением на аГИ-РТПХ после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК).

• Исследователи стремятся выяснить, может ли быть достигнута ранняя диагностика aGI-GvHD в двенадцатиперстной кишке и тощей кишке путем оценки эндомикроскопических признаков.
• По сравнению с обычными биопсиями из упомянутых отделов ЖКТ в качестве золотого стандарта исследователи хотят проверить, соответствуют ли маркеры, описанные Bojarski et al. для толстой кишки также справедливы для тонкой кишки.
• Включая результаты эндомикроскопии пациентов с глютеновой болезнью, энтеральными инфекциями, воспалительными заболеваниями кишечника и здоровых субъектов в качестве контроля, исследователи стремятся установить специфические маркеры aGI-GvHD, которые можно использовать для диагностики in vivo aGI-GvHD без биопсии.

Дизайн исследования

Проспективное клиническое пилотное исследование без рандомизации или ослепления

Исследуемая популяция

Пациенты после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК), направленные в исследовательский центр для уточнения одного из следующих симптомов:

• анорексия
• тошнота
• рвота
• боль в животе
• диарея
• кишечное кровотечение

Чтобы исключить возможные побочные эффекты кондиционирующей терапии, желудочно-кишечные симптомы должны были проявиться или сохраняться в течение 20 дней после соответствующей даты трансплантации [22].

Критерий исключения:

• инфицирование ЦМВ или ВПГ
• бактериальная инфекция желудочно-кишечного тракта
• симптомы, связанные с приемом лекарств
• пациенты с аллергией на один из компонентов препарата (включая препараты, используемые для седации в сознании, такие как пропофол или мидазолам, а также флуоресцеин, флуоресцентный краситель, используемый для CLE)
• отказ от участия в исследовании
• возраст пациента до 18 лет.

Методы

Это исследование будет проведено в Медицинском университете Вены, на кафедре внутренних болезней III, отделении гастроэнтерологии и гепатологии. Набор пациентов будет осуществляться в тесном сотрудничестве с отделением внутренних болезней I отделения онкологии отделения трансплантации костного мозга.

Поскольку это исследование было запланировано как пилотное, оно в основном сосредоточено на качественных эндомикроскопических характеристиках тонкой кишки у пациентов с БТПХ, чтобы определить эталонные патологии для точной диагностики в будущем. Тем не менее, будет проведен количественный анализ путем сравнения диагнозов, полученных с помощью CLE, с гистологическими результатами, чтобы рассчитать чувствительность и специфичность диагностики aGI-GvHD на основе CLE в тонкой кишке. Принимая во внимание текущую диагностическую ценность 62% для обнаружения aGI-GvHD у пациентов с симптомами после ТГСК с помощью традиционной гистологии [19], исследователи оценили включение 40 пациентов с подозрением на aGI-GvHD, чтобы обнаружить значимую выборку пациентов. пострадавших от aGI-GvHD для качественного и количественного анализа. Для сравнения, Bojarski et al. включили 35 пациентов, 19 из которых в конечном итоге оказались страдающими от aGI-GvHD по традиционной гистологии. Затем они могли рассчитать чувствительность 74% и специфичность 100% для прогнозирования гистологического диагноза с помощью CLE [21]. Основываясь на текущей частоте пациентов после ТГСК в исследовательском центре, исследователи оценивают, что нужно включить целевое количество 40 пациентов в течение 2-летнего периода.

Все пациенты, соответствующие перечисленным критериям включения, получат информационную форму пациента для этого исследования вместе с обычной формой информированного согласия на соответствующее эндоскопическое исследование, которое они собираются пройти. Информация о пациенте будет предоставлена ​​как минимум за 24 часа до вмешательства, как это практикуется в нашем отделении. Если пациент соглашается участвовать в исследовании, он/она будет подготовлен к эндоскопии путем внутривенного введения пропофола и/или мидазолама, которые обычно используются для седации в сознании во время эндоскопических процедур в нашем отделении. Дополнительно внутривенно вводят 5-10 мл 10% раствора флуоресцеина натрия для усиления флуоресценции тканей при эндомикроскопии. Поскольку пока нет специального CLE-энтероскопа, мы будем использовать CLE-колоноскоп (Pentax EC-3870 CIFK с процессором конфокальной эндомикроскопии ISC-1000 - Pentax, Токио, Япония и Optiscan Pty Ltd, Ноттинг-Хилл, Виктория, Австралия) для достижения тонкой кишки, сравнимой с энтероскопической процедурой (оральный доступ).

Все лекарства будут вводиться медицинскими специалистами, помощниками врачей или дипломированными медсестрами, как это обычно практикуется в нашем учреждении.

Захват изображения CLE начнется с самой глубокой точки тощей кишки. Во время извлечения эндоскопа изображения CLE будут делаться каждые 10 сантиметров в тонкой кишке, затем в антральном отделе и теле желудка и в пищеводе. Кроме того, CLE будет применяться для четко выглядящих областей, подозрительных на патологическое происхождение. Где бы ни были получены изображения CLE, обычная биопсия будет взята из той же локализации.

Изображения CLE будут захвачены и сохранены в обычном порядке с использованием нашей стандартной системы управления данными. Они будут оценены сразу после эндоскопической процедуры вместе с сертифицированным патологом желудочно-кишечного тракта, который установит первоначальный диагноз.

Обычные биопсии окрашивают гематоксилином и эозином, а также красят PAS. Для исключения вирусной инфекции будет проведена гибридизация in situ для ЦМВ и ВПГ. Классификация GvHD будет проводиться по McDonald и Sale по 4 классам, соответствующим образом модифицированным для тонкой кишки [23]:

• I степень: некроз отдельных клеток
• II степень: абсцесс крипты
• III степень: выпадение одной или более целых крипт в биоптате
• Степень IV: полное оголение эпителия.

Эндомикроскопические контроли (пациенты с глютеновой болезнью, энтеральными инфекциями, воспалительными заболеваниями кишечника и здоровые субъекты) будут собраны из имеющихся данных эндомикроскопических процедур, уже выполненных в рамках рутинных обследований.

В конце исследования все изображения CLE и гистологические срезы будут оцениваться отдельно двумя сертифицированными патологоанатомами вслепую. В случае противоречивых диагнозов они будут вместе анализировать соответствующие случаи, чтобы прийти к соглашению об окончательном диагнозе. Все случаи, когда первоначальный и окончательный диагнозы отклоняются друг от друга, будут совместно переоцениваться всеми привлеченными специалистами.

Оценка риска/выгоды

GvHD представляет собой основную причину заболеваемости и смертности после аллогенной ТГСК. Приблизительно у 10-40% пациентов, перенесших ТГСК, развивается выраженная РТПХ, и около половины этих пациентов умирают от этого заболевания или от осложнений терапии [1].

Эндоскопические процедуры у пациентов с подозрением на аГИ-РТПХ хорошо зарекомендовали себя. До сих пор гистологическая оценка биоптатов желудочно-кишечного тракта является золотым стандартом для постановки точного диагноза aGI-GvHD. Эндоскопия верхних отделов желудочно-кишечного тракта более удобна, чем эндоскопическая оценка нижних отделов желудочно-кишечного тракта, поскольку не требует подготовки кишечника. Поэтому это основной метод оценки пациентов после ТГСК в нашем отделении. Подтвержденные недавними результатами в исследовательском учреждении [19], эти эндоскопии верхних отделов желудочно-кишечного тракта обычно выполняются как энтероскопии вместо гастроскопии, чтобы включить тонкий кишечник в диагностическую оценку. Безопасность энтероскопии систематически не изучалась, но сообщается о значительном опыте, а осложнения возникают редко [24].

Конфокальная лазерная эндомикроскопия — новый безопасный метод, который уже прошел клинические испытания [25, 26]. Его безопасность обеспечивается использованием лазерного излучения низкой интенсивности, способного в худшем случае вызвать локальное обесцвечивание флуоресцеинсодержащих клеток, безвредное, обратимое и даже используемое в качестве диагностического признака в экспериментальных условиях [20].

Этические последствия

Этот протокол исследования был одобрен комиссией по этике Венского медицинского университета.

Все процедуры в контексте этого исследования будут выполняться в соответствии с Хельсинкской декларацией, а также с руководящими принципами надлежащей научной практики (GSP) Венского медицинского университета.

Ожидаемый эффект и перспективы

Если исследователи обнаружат специфические маркеры aGI-GvHD, которые можно использовать для «безбиопсийной» диагностики in vivo aGI-GvHD, это может привести к еще одному сокращению инвазивных процедур для пациентов после ТГСК. Это имело бы большое клиническое значение, поскольку оценка биопсии часто ограничена плохим статусом коагуляции у этой группы пациентов.

В случае, если они не могут четко определить специфические маркеры aGI-GvHD, CLE должна, по крайней мере, уменьшить количество обычных биопсий, необходимых для диагностики, взяв их под контроль CLE.

Несмотря на ожидаемое сокращение инвазивных процедур, диагностика aGI-GvHD in vivo может привести к немедленному началу иммуносупрессивной терапии, чтобы уменьшить прогрессирование и распространение заболевания.

В случае, если цели исследования будут подтверждены результатами этого пилотного исследования, будет проведено рандомизированное контролируемое исследование, в котором будет проведено сравнение диагностики in vivo с обычной гистологической оценкой в ​​вопросах госпитализации и выживаемости.