Endomikroskopie a onemocnění štěpu proti hostiteli

Graft-versus-host disease (GvHD) představuje hlavní příčinu morbidity a mortality u pacientů, kteří podstoupili transplantaci hematopoetických kmenových buněk (HSCT) [1]. V gastrointestinálním traktu jako jednom z hlavních cílových orgánů může být diagnostika GvHD obtížná kvůli mnoha podobným prezentujícím diferenciálním diagnózám, z nichž nejvýznamnější jsou infekce cytomegalovirem [2]. Odborníci se neshodnou na nejlepším diagnostickém přístupu u pacientů s podezřením na akutní gastrointestinální GvHD (aGI-GvHD). Existuje mnoho studií podporujících endoskopické hodnocení buď dolní [3, 4, 5], horní [6, 7] nebo obou částí GI traktu [8, 9]. V obou případech slouží histologické hodnocení vzorků biopsie jako standardní nástroj ke stanovení konečné diagnózy [10].

Vzhledem k dosti špatnému celkovému stavu pacientů po HSCT jako limitujícímu faktoru pro endoskopické a histologické vyšetření byly do diagnostického manuálu aGI-GvHD zavedeny některé nové přístupy s cílem snížit množství invazivních vyšetření. Konvenční zobrazovací techniky jako magnetická rezonance [11], počítačová tomografie [12] a ultrasonografie s vysokým rozlišením s dopplerovským zobrazením [13] uváděly ztluštění střevní stěny u pacientů s GvHD. Ale protože takové nálezy jsou pouze nespecifickými známkami gastrointestinální patologie, konvenční zobrazovací techniky nemohou nahradit endoskopii biopsií [14]. Totéž platí pro videokapsulovou endoskopii, u které bylo skutečně zjištěno, že má vysokou negativní prediktivní hodnotu pro detekci aGI-GvHD, ale sdílí důležitý nedostatek chybějících bioptických vzorků pro histologické hodnocení [15, 16, 17].

Alespoň tato metoda přesunula ohnisko zájmu na tenké střevo. Biopsie pocházející z této dříve opomíjené části GI prokázaly v předchozích studiích vysokou citlivost na změny související s GvHD [18]. Vzhledem k tomu, že na místě studie byly pozorovány podobné výsledky, vyšetřovatelé prospektivně porovnávali enteroskopii s biopsií se současným zlatým standardem v diagnostické léčbě aGI-GvHD, kolonoskopií s biopsií. V kontextu tohoto šetření vykazovalo tlusté střevo mnohem silnější postižení aGI-GvHD než všechny ostatní lokality, i když neexistovala dvojice vyšetření, při kterých by kolonoskopie odhalila aGI-GvHD bez přítomnosti takových nálezů při enteroskopii. Právě naopak, enteroskopie dokonce odhalila patologie související s GvHD v jednom případě, kdy příslušná kolonoskopie zůstala nenápadná. V důsledku toho předpokládali, že enteroskopické nálezy mohou nahradit potřebu kolonoskopie [19], takže pacienti po HSCT mohou zůstat bez stresující přípravy střeva, často omezeni svým dosti špatným celkovým stavem.

Jedním z nejnovějších pokroků v endoskopické léčbě gastrointestinálního traktu je tzv. konfokální laserový endomikroskop (CLE). Konfokální mikroskopii vyvinul Marvin Minsky na konci 50. let 20. století. Jeho principem je mikroskopické skenování ohnisek pod povrchem předmětu. Ve srovnání s konvenční světelnou mikroskopií využívá speciální filtrační systém, aby nedocházelo k překrývání obrazu okolní tkání. V detailu je světelný zdroj (obvykle laser) zaostřen čočkou mikroskopu na difrakčně omezený bod na objektu nebo uvnitř objektu. Světlo, které je rozptýlené nebo fluorescenčně excitované (dosahované například barvením fluoresceinem) a emitované v ohnisku ve vzorku, se částečně vrátí zpět optikou podél cesty, ze které dorazilo. Dělič paprsku umístěný do dráhy odráží zpětné světlo směrem k detektoru. Optika zaměří světlo z ohniska ve vzorku do jeho konjugovaného ohniska blízko detektoru (proto se tato technologie nazývá "konfokální"). Zde se používá prostorový filtr ("pinhole") k uhašení veškerého světla pocházejícího z oblastí mimo ohnisko. Odrazy světla od samotného ohniska budou předány do detektoru, který je připojen k počítačovému systému, který digitalizuje optický signál a vytváří in vivo histologický obraz [20].

Konfokální mikroskopie se zaměřením na klinický dopad je první technikou, která umožňuje in vivo hodnocení tkáňových struktur pod jejich povrchem. Vzhledem k mnoha průlomům v miniaturizaci (většinou v 90. letech 20. století) mohla být tato technologie použita pro intraluminální použití v gastroenterologii, integrována do jinak standardního endoskopu. Umožňuje in vivo histologickou vizualizaci horních 250 mikrometrů všech stěn v gastrointestinálním traktu, navíc k normální funkci endoskopie bílého světla (poskytované dvěma samostatnými obrazovkami v horní části pracovní stanice) [20].

První klinické použití CLE v prospektivní pilotní studii zahrnující 35 pacientů po HSCT uvedli Bojarski et al. v roce 2009. CLE sliznice tlustého střeva mohla predikovat pozitivní diagnózu aGI-GvHD u ​​14 z 19 pacientů, později potvrzenou histologickým vyšetřením. Nálezy aGI-GvHD in vivo, které se lišily od apoptózy jedné krypty až po úplnou ztrátu krypt, byly jasně odlišitelné od patologických stavů jiného původu, jako je infekční kolitida nebo ulcerózní kolitida, obě byly použity jako srovnávací kontrola [21].

Studijní cíle

V tomto klinickém zkoumání mají výzkumníci v úmyslu pokračovat v diagnostickém přístupu pro akutní onemocnění gastrointestinálního štěpu proti hostiteli (aGI-GvHD). Na základě nedávných výsledků ve studijní instituci (vysvětleno výše, [19]), které ukázaly pozoruhodný diagnostický výtěžek pro patologické stavy spojené s aGI-GvHD v tenkém střevě, hodlají vědci hodnotit konfokální laserovou endomikroskopii (CLE) tenkého střeva jako primární diagnostický postup u pacientů s podezřením na aGI-GvHD po transplantaci hematopoetických kmenových buněk (HSCT).

• Vyšetřovatelé si kladou za cíl zjistit, zda lze včasnou diagnostiku aGI-GvHD v duodenu a jejunu dosáhnout vyhodnocením endomikroskopických znaků.
• Ve srovnání s konvenčními biopsiemi z uvedených částí GI jako zlatým standardem chtějí vědci otestovat, zda markery popsané Bojarskim et al. pro tlusté střevo platí také pro tenké střevo.
• Včetně endomikroskopických výsledků pacientů s celiakií, enterálními infekcemi, zánětlivým onemocněním střev a zdravých subjektů jako kontrol se výzkumníci zaměřují na stanovení specifických markerů aGI-GvHD, které lze použít pro diagnostiku aGI-GvHD „bez biopsie“ in vivo.

Studovat design

Prospektivní klinická pilotní studie bez randomizace nebo zaslepení

Studijní populace

Pacienti po transplantaci hematopoetických kmenových buněk (HSCT), kteří jsou odesláni na místo studie za účelem objasnění jednoho z následujících příznaků:

• anorexie
• nevolnost
• zvracení
• bolest břicha
• průjem
• střevní krvácení

Aby se vyloučily možné vedlejší účinky kondicionační terapie, musí se GI symptomy objevit nebo přetrvávat 20 dní po příslušném datu transplantace [22].

Kritéria vyloučení:

• infekce CMV nebo HSV
• bakteriální infekce GI traktu
• symptomy související s léky
• pacienti alergičtí na jednu ze složek léku (včetně léků používaných k sedaci při vědomí, jako je propofol nebo midazolam, stejně jako fluorescein, fluorescenční barvivo používané pro CLE)
• odmítnutí účasti ve studii
• věk pacienta pod 18 let.

Metody

Toto vyšetření bude provedeno na Lékařské univerzitě ve Vídni, oddělení vnitřního lékařství III, oddělení gastroenterologie a hepatologie. Nábor pacientů bude probíhat v úzké spolupráci s Interní klinikou I., Onkologické oddělení Transplantační jednotky kostní dřeně.

Vzhledem k tomu, že tato studie byla plánována jako pilotní, zaměřuje se hlavně na kvalitativní endomikroskopické rysy tenkého střeva u pacientů s GvHD, aby se v budoucnu získaly referenční patologie pro přesnou diagnózu. Nicméně bude provedena kvantitativní analýza porovnáním diagnóz odvozených z CLE s histologickými výsledky, aby se vypočítala senzitivita a specificita diagnózy aGI-GvHD založené na CLE v tenkém střevě. S ohledem na současnou diagnostickou výtěžnost 62 % pro detekci aGI-GvHD u ​​symptomatických pacientů po HSCT konvenční histologií [19] vyšetřovatelé odhadli, že zahrnují 40 pacientů s podezřením na aGI-GvHD, aby objevili smysluplný vzorek pacientů ovlivněné aGI-GvHD pro kvalitativní a kvantitativní analýzu. Pro srovnání, Bojarski et al zahrnovali 35 pacientů, z nichž 19 nakonec podle konvenční histologie trpělo aGI-GvHD. Poté mohli vypočítat senzitivitu 74 % a specificitu 100 % pro predikci histologické diagnózy pomocí CLE [21]. Na základě aktuální frekvence post-HSCT pacientů na místě studie odhadují výzkumníci zahrnout cílový počet 40 pacientů v časovém období 2 let.

Všichni pacienti, kteří splňují uvedená kritéria pro zařazení, obdrží informační formulář pro pacienty této studie spolu s obvyklým formulářem informovaného souhlasu příslušného endoskopického vyšetření, které se chystají podstoupit. Informování pacienta bude provedeno nejméně 24 hodin před zásahem, jak je praktikováno na naší jednotce. Pokud pacient souhlasí s účastí ve studii, bude připraven na endoskopii podáním intravenózního propofolu a/nebo midazolamu, které se běžně používají k sedaci při vědomí při endoskopických výkonech na našem oddělení. Kromě toho bude intravenózně podáno 5-10 ml 10% roztoku fluoresceinu sodného pro zvýšení fluorescence tkáně během endomikroskopie. Protože zatím není k dispozici žádný specifický CLE-enteroskop, budeme používat CLE-kolonoskop (Pentax EC-3870 CIFK s procesorem pro konfokální endomikroskopii ISC-1000 - Pentax, Tokio, Japonsko a Optiscan Pty Ltd, Notting Hill, Victoria, Austrálie) k dosažení tenkého střeva, srovnatelné s enteroskopickým postupem (orální přístup).

Všechny léky budou podávat lékařští specialisté, pomocní lékaři nebo registrované zdravotní sestry, jak je v našem ústavu běžné.

Snímání obrazu CLE začne v nejhlubším místě dosažitelného v jejunu. Při vytahování dalekohledu budou snímky CLE pořizovány každých 10 centimetrů v tenkém střevě, poté z antra a těla žaludku az jícnu. Kromě toho bude CLE aplikován na odlišně vyhlížející oblasti, podezřelé z patologického původu. Kdekoli jsou získány snímky CLE, bude konvenční biopsie odebrána ze stejné lokalizace.

Obrázky CLE budou zachycovány a ukládány rutinně pomocí našeho standardního systému správy dat. Bezprostředně po endoskopickém výkonu budou vyšetřeni společně s certifikovaným GI-patologem, který stanoví prvotní diagnózu.

Konvenční biopsie budou obarveny hematoxylinem a eosinem, stejně jako barvením PAS. Pro vyloučení virové infekce bude provedena in-situ hybridizace pro CMV a HSV. Klasifikace GvHD bude provedena podle McDonald and Sale ve 4 stupních, vhodně upravených pro tenké střevo [23]:

• Stupeň I: individuální nekróza buněk
• Stupeň II: absces krypty
• Stupeň III: při biopsii vypadne jedna nebo více celých krypt
• Stupeň IV: úplná denudace epitelu

Endomikroskopické kontroly (pacienti s celiakií, enterálními infekcemi, zánětlivými střevními onemocněními a zdraví jedinci) budou sbírány ze současných dat endomikroskopických výkonů již provedených v rámci rutinních vyšetření.

Na konci studie budou všechny snímky CLE a histologické řezy samostatně hodnoceny dvěma zaslepenými certifikovanými patology. V případě neshodných diagnóz společně analyzují příslušné případy, aby se shodli na konečné diagnóze. Všechny případy, kdy se výchozí a konečná diagnóza od sebe liší, budou společně přehodnoceny všemi zúčastněnými specialisty.

Posouzení rizika/přínosu

GvHD představuje hlavní příčinu morbidity a mortality po alogenní HSCT. Přibližně u 10–40 % pacientů, kteří podstoupí HSCT, se rozvine signifikantní GvHD a asi polovina těchto pacientů na toto onemocnění nebo na komplikace vyplývající z terapie zemře [1].

Endoskopické výkony u pacientů s podezřením na aGI-GvHD jsou dobře zavedené. Až dosud je histologické hodnocení biopsií pocházejících z GI zlatým standardním nástrojem pro stanovení přesné diagnózy aGI-GvHD. Endoskopie horního GI traktu je pohodlnější než endoskopické vyšetření dolního GI traktu, protože není potřeba preparace střeva. Proto je primární technikou hodnocení pacientů po HSCT na našem oddělení. Na základě nedávných výsledků ve studijním zařízení [19] se tyto endoskopie horního GI rutinně provádějí jako enteroskopie namísto gastroskopií, aby se do diagnostického hodnocení zahrnulo i tenké střevo. Bezpečnost enteroskopie nebyla systematicky studována, ale uváděné zkušenosti jsou značné a komplikace byly vzácné [24].

Konfokální laserová endomikroskopie je bezpečná nová technika, která již byla studována v klinických studiích [25, 26]. Jeho bezpečnost je zaručena použitím laserového světla s nízkou intenzitou, které může v nejhorším případě způsobit lokální vybělení buněk obsahujících fluorescein, které je neškodné, reverzibilní a dokonce se používá jako diagnostický znak v experimentálních podmínkách [20].

Etické důsledky

Tento protokol studie byl schválen etickou komisí Lékařské univerzity ve Vídni.

Všechny postupy v rámci této studie budou prováděny v souladu s Helsinskou deklarací a také s pokyny pro správnou vědeckou praxi (GSP) Lékařské univerzity ve Vídni.

Očekávaný dopad a výhled

Pokud vyšetřovatelé najdou aGI-GvHD specifické markery, které lze použít pro "bezbiopsii" in vivo diagnostiku aGI-GvHD, mohlo by to vést k dalšímu snížení invazivních postupů u pacientů po HSCT. To by mělo velký klinický dopad, protože bioptické hodnocení je často omezeno špatným koagulačním stavem této skupiny pacientů.

V případě, že nemohou jasně určit specifické markery aGI-GvHD, CLE by měla alespoň snížit množství konvenčních biopsií potřebných k diagnóze tím, že je podstoupí vedení CLE.

Navzdory očekávanému snížení invazivních postupů by diagnostika aGI-GvHD in vivo mohla vést k okamžitému zahájení imunosupresivní léčby za účelem snížení progrese a lokálního šíření onemocnění.

V případě, že cíle studie budou podpořeny výsledky této pilotní studie, bude provedena randomizovaná kontrolovaná studie srovnávající diagnostiku in vivo s konvenčním histologickým hodnocením ve věcech hospitalizace a přežití.