Endomicroscopia e Doença do Enxerto contra o Hospedeiro

A doença do enxerto contra o hospedeiro (GvHD) representa uma das principais causas de morbidade e mortalidade em pacientes submetidos a transplante de células-tronco hematopoiéticas (HSCT) [1]. No trato gastrointestinal, como um dos principais órgãos-alvo do GvHD, o diagnóstico pode ser difícil devido a muitos diagnósticos diferenciais semelhantes, sendo o mais notável, infecções por citomegalovírus [2]. Os especialistas discordam sobre a melhor abordagem diagnóstica para pacientes com suspeita de GvHD gastrointestinal aguda (aGI-GvHD). Existem muitos estudos que apoiam a avaliação endoscópica da parte inferior [3, 4, 5], da parte superior [6, 7] ou de ambas as partes do trato gastrointestinal [8, 9]. Em ambos os casos, a avaliação histológica das amostras de biópsia serve como ferramenta padrão para estabelecer o diagnóstico final [10].

Considerando o péssimo estado geral dos pacientes após o TCTH como um fator limitante para a avaliação endoscópica e histológica, algumas novas abordagens foram introduzidas no manual de diagnóstico de aGI-GvHD a fim de reduzir a quantidade de exames invasivos. Técnicas de imagem convencionais, como ressonância magnética [11], tomografia computadorizada [12] e ultrassonografia de alta resolução com Doppler Imaging [13], relataram espessamento da parede intestinal em pacientes com GvHD. Mas como tais achados são apenas sinais inespecíficos de patologia gastrointestinal, as técnicas de imagem convencionais não podem substituir a endoscopia por biópsias [14]. O mesmo vale para a videocápsula endoscópica, que de fato demonstrou ter um alto valor preditivo negativo para a detecção de aGI-GvHD, mas compartilha a importante deficiência de amostras de biópsia ausentes para avaliação histológica [15, 16, 17].

Pelo menos esse método mudou o foco de interesse para o intestino delgado. Biópsias derivadas dessa antiga parte GI negligenciada mostraram uma alta sensibilidade para alterações relacionadas ao GvHD em estudos anteriores [18]. Como resultados semelhantes foram observados no local do estudo, os investigadores compararam prospectivamente a enteroscopia com biópsias com o atual padrão-ouro no manejo diagnóstico de aGI-GvHD, colonoscopia com biópsias. No contexto desta investigação o intestino grosso apresentou acometimento muito mais forte por aGI-GvHD do que todas as outras localizações, embora não tenha havido par de exames, em que a colonoscopia revelou aGI-GvHD sem a presença de tais achados na enteroscopia. Muito pelo contrário, a enteroscopia revelou mesmo patologias relacionadas com GvHD num caso em que a respetiva colonoscopia permaneceu imperceptível. Consequentemente, eles postularam que os achados enteroscópicos podem substituir a necessidade de colonoscopia [19], portanto, os pacientes pós-TCTH podem permanecer sem preparo intestinal estressante, muitas vezes limitados por seu estado geral bastante ruim.

Um dos últimos desenvolvimentos no manejo endoscópico do trato gastrointestinal é o chamado endomicroscópio confocal a laser (CLE). A microscopia confocal foi desenvolvida por Marvin Minsky no final da década de 1950. Seu princípio é a varredura microscópica de pontos focais abaixo da superfície de um objeto. Em comparação com a microscopia de luz convencional, ela usa um sistema de filtro especial para evitar a sobreposição da imagem pelo tecido circundante. Em detalhes, uma fonte de luz (normalmente um laser) é focalizada por uma lente objetiva de microscópio em um ponto limitado por difração no objeto ou dentro dele. A luz que é espalhada, ou fluorescência excitada (obtida por meio de coloração com fluoresceína, por exemplo) e emitida, no foco da amostra retornará parcialmente pela ótica ao longo do caminho de onde veio. Um divisor de feixe colocado no caminho reflete a luz de retorno em direção a um detector. A ótica focará a luz do ponto focal na amostra para seu foco conjugado próximo ao detector (por isso a tecnologia é chamada de "confocal"). Aqui, um filtro espacial ("pinhole") é usado para extinguir toda a luz proveniente de áreas fora do ponto focal. As reflexões de luz do próprio ponto focal serão encaminhadas para o detector que está conectado a um sistema de computador que digitaliza o sinal óptico e cria a imagem histológica in vivo [20].

Com foco em seu impacto clínico, a microscopia confocal é a primeira técnica a permitir a avaliação in vivo de estruturas de tecido abaixo de sua superfície. Devido a muitos avanços na miniaturização (principalmente na década de 1990), essa tecnologia pode ser aplicada para uso intraluminal em gastroenterologia, integrada a um endoscópio padrão. Permite a visualização histológica in vivo dos 250 micrômetros superiores de todas as paredes do trato gastrointestinal, além da função normal da endoscopia com luz branca (fornecida por duas telas separadas no topo da estação de trabalho) [20].

O primeiro uso clínico de CLE em um estudo piloto prospectivo incluindo 35 pacientes após o TCTH foi relatado por Bojarski et al. em 2009. O CLE da mucosa colônica pode predizer o diagnóstico positivo de aGI-GvHD em 14 dos 19 pacientes, posteriormente confirmado por avaliação histológica. Os achados in vivo de aGI-GvHD, variando de apoptose de cripta única a perda completa de cripta, foram claramente distinguíveis de patologias de outras origens, como colite infecciosa ou colite ulcerativa, ambas usadas como controle comparativo [21].

Objetivos do estudo

Nesta investigação clínica, os investigadores pretendem continuar a abordagem diagnóstica para a doença gastrointestinal aguda do enxerto contra o hospedeiro (aGI-GvHD). Com base nos resultados recentes na instituição de estudo (explicados acima, [19]) que mostraram um rendimento diagnóstico notável para patologias associadas aGI-GvHD no intestino delgado, os investigadores pretendem avaliar a endomicroscopia confocal a laser (CLE) do intestino delgado como primário procedimento diagnóstico em pacientes com suspeita de aGI-GvHD após transplante de células-tronco hematopoiéticas (HSCT).

• Os investigadores pretendem examinar se o diagnóstico precoce de aGI-GvHD no duodeno e no jejuno pode ser alcançado pela avaliação das características endomicroscópicas.
• Em comparação com biópsias convencionais das partes GI mencionadas como padrão-ouro, os investigadores querem testar se os marcadores descritos por Bojarski et al. para o cólon também vale para o intestino delgado.
• Incluindo resultados endomicroscópicos de pacientes com doença celíaca, infecções entéricas, doença inflamatória intestinal e indivíduos saudáveis ​​como controles, os investigadores pretendem estabelecer marcadores específicos de aGI-GvHD que possam ser usados ​​para um diagnóstico in vivo "livre de biópsia" de aGI-GvHD.

Design de estudo

Ensaio piloto clínico prospectivo sem randomização ou cegamento

População do estudo

Pacientes após transplante de células-tronco hematopoiéticas (HSCT) encaminhados ao local do estudo para esclarecimento de um dos seguintes sintomas:

• anorexia
• náusea
• vômito
• dor abdominal
• diarréia
• sangramento intestinal

Para excluir possíveis efeitos colaterais da terapia de condicionamento, os sintomas gastrointestinais devem ter ocorrido ou persistido 20 dias após a data do respectivo transplante [22].

Critério de exclusão:

• infecção por CMV ou HSV
• infecção bacteriana do trato GI
• sintomas relacionados a medicamentos
• pacientes alérgicos a um dos componentes do medicamento (incluindo medicamentos usados ​​para sedação consciente, como propofol ou midazolam, bem como fluoresceína, o corante fluorescente usado para CLE)
• recusa em participar do estudo
• idade do paciente abaixo de 18 anos.

Métodos

Esta investigação será realizada na Universidade Médica de Viena, Departamento de Medicina Interna III, Divisão de Gastroenterologia e Hepatologia. O recrutamento de pacientes será realizado em estreita cooperação com o Departamento de Medicina Interna I, Divisão de Oncologia, Unidade de Transplante de Medula Óssea.

Como este estudo foi planejado como um ensaio piloto, ele se concentra principalmente nas características endomicroscópicas qualitativas do intestino delgado em pacientes com GvHD para produzir patologias de referência para um diagnóstico preciso no futuro. No entanto, uma análise quantitativa será realizada comparando diagnósticos derivados de CLE com resultados histológicos para calcular a sensibilidade e especificidade do diagnóstico de aGI-GvHD baseado em CLE no intestino delgado. Considerando o rendimento diagnóstico atual de 62% para a detecção de aGI-GvHD em pacientes sintomáticos pós-TCTH por histologia convencional [19], os investigadores estimaram incluir 40 pacientes com suspeita de aGI-GvHD para descobrir uma amostra significativa de pacientes afetados por aGI-GvHD para análise qualitativa e quantitativa. Em comparação, Bojarski et al incluíram 35 pacientes, dos quais 19 acabaram sofrendo de aGI-GvHD pela histologia convencional. Eles poderiam então calcular uma sensibilidade de 74% e especificidade de 100% para a previsão do diagnóstico histológico por CLE [21]. Com base na frequência atual de pacientes pós-TCTH no local do estudo, os investigadores estimam incluir a quantidade pretendida de 40 pacientes em um período de 2 anos.

Todos os pacientes que preencherem os critérios de inclusão listados receberão o formulário de informações do paciente deste estudo, juntamente com o formulário de consentimento informado usual do respectivo exame endoscópico a que serão submetidos. A informação do paciente será feita pelo menos 24 horas antes da intervenção, conforme praticado em nossa unidade. Caso o paciente concorde em participar do estudo, ele será preparado para endoscopia pela administração de propofol e/ou midazolam intravenoso, como rotineiramente usado para sedação consciente durante procedimentos endoscópicos em nosso departamento. Além disso, 5-10 ml de uma solução de fluoresceína sódica a 10% serão administrados por via intravenosa para aumentar a fluorescência do tecido durante a endomicroscopia. Como até o momento nenhum enteroscópio CLE específico está disponível, usaremos o colonoscópio CLE (Pentax EC-3870 CIFK com o processador de endomicroscopia confocal ISC-1000 - Pentax, Tóquio, Japão e Optiscan Pty Ltd, Notting Hill, Victoria, Austrália) para atingir o intestino delgado, comparável a um procedimento enteroscópico (acesso oral).

Todos os medicamentos serão administrados por médicos especialistas, médicos assistentes ou enfermeiras registradas, conforme praticado rotineiramente em nossa instituição.

A captura da imagem CLE começará no ponto mais profundo alcançável no jejuno. Durante a retirada do endoscópio, as imagens do CLE serão tiradas a cada 10 centímetros no intestino delgado, depois no antro e corpo do estômago e no esôfago. Além disso, o CLE será aplicado para áreas de aspecto distinto, suspeitas de origem patológica. Onde quer que as imagens CLE sejam obtidas, uma biópsia convencional será realizada no mesmo local.

As imagens CLE serão capturadas e armazenadas rotineiramente usando nosso sistema de gerenciamento de dados padrão. Eles serão avaliados imediatamente após o procedimento endoscópico junto com um patologista GI certificado, que estabelecerá um diagnóstico inicial.

Biópsias convencionais serão coradas com hematoxilina e eosina, bem como coloração PAS. A hibridação in situ para CMV e HSV será realizada para excluir a infecção viral. A classificação da GvHD será feita de acordo com McDonald e Sale em 4 graus, devidamente modificados para o intestino delgado [23]:

• Grau I: necrose celular individual
• Grau II: abscesso de cripta
• Grau III: abandono de uma ou mais criptas inteiras em uma biópsia
• Grau IV: desnudamento total do epitélio

Controles endomicroscópicos (pacientes com doença celíaca, infecções enterais, doença inflamatória intestinal e indivíduos saudáveis) serão coletados a partir de dados atuais de procedimentos endomicroscópicos já realizados em exames de rotina.

No final do estudo, todas as imagens de CLE e cortes histológicos serão avaliados separadamente por dois patologistas certificados. Em caso de diagnósticos discordantes, eles analisarão os respectivos casos em conjunto para chegar a um acordo sobre o diagnóstico final. Todos os casos em que o diagnóstico inicial e final estiverem divergentes entre si serão reavaliados em conjunto por todos os especialistas envolvidos.

Avaliação de risco/benefício

GvHD representa uma das principais causas de morbidade e mortalidade após o TCTH alogênico. Aproximadamente 10-40% dos pacientes que se submetem ao TCTH desenvolvem GvHD significativa, e cerca de metade desses pacientes morre desta doença ou de complicações resultantes da terapia [1].

Procedimentos endoscópicos em pacientes com suspeita de aGI-GvHD estão bem estabelecidos. Até agora, a avaliação histológica de biópsias derivadas de GI é a ferramenta padrão-ouro para estabelecer um diagnóstico preciso de aGI-GvHD. A endoscopia do trato GI superior é mais confortável do que a avaliação endoscópica do trato GI inferior, pois não há necessidade de preparo intestinal. Portanto, é a principal técnica para avaliar pacientes pós-TCTH em nosso departamento. Com base em resultados recentes na instituição do estudo [19], essas endoscopias digestivas altas são rotineiramente realizadas como enteroscopias em vez de gastroscopias, a fim de incluir o intestino delgado na avaliação diagnóstica. A segurança da enteroscopia não foi estudada sistematicamente, mas a experiência relatada é substancial e as complicações foram raras [24].

A endomicroscopia confocal a laser é uma nova técnica segura que já foi estudada em ensaios clínicos [25, 26]. Sua segurança está sendo garantida pelo uso de luz laser de baixa intensidade que pode, na pior das hipóteses, causar branqueamento local de células contendo fluoresceína, que é inócuo, reversível e até usado como sinal diagnóstico em condições experimentais [20].

Implicações éticas

Este protocolo de estudo foi aprovado pela comissão de ética da Universidade Médica de Viena.

Todos os procedimentos no contexto deste estudo serão realizados de acordo com a Declaração de Helsinque, bem como com as diretrizes de Boas Práticas Científicas (GSP) da Universidade Médica de Viena.

Impacto esperado e Perspectivas

Se os investigadores encontrarem marcadores específicos de aGI-GvHD que possam ser usados ​​para um diagnóstico in vivo "livre de biópsia" de aGI-GvHD, isso poderá levar a outra redução de procedimentos invasivos para pacientes após o HSCT. Isso teria um grande impacto clínico, pois a avaliação da biópsia é frequentemente limitada pelo estado de má coagulação desse grupo de pacientes.

Caso eles não possam determinar claramente marcadores específicos de aGI-GvHD, o CLE deve pelo menos reduzir a quantidade de biópsias convencionais necessárias para o diagnóstico, levando-as sob a orientação do CLE.

Apesar da esperada redução de procedimentos invasivos, o diagnóstico in vivo de aGI-GvHD pode levar ao início imediato do tratamento imunossupressor, a fim de reduzir a progressão e a disseminação local da doença.

Caso os objetivos do estudo sejam apoiados pelos resultados deste estudo piloto, será realizado um estudo randomizado controlado comparando o diagnóstico in vivo com a avaliação histológica convencional em questões de hospitalização e sobrevivência.