Endomikroskopi og graft-versus-host sygdom

Graft-versus-host-sygdom (GvHD) repræsenterer en væsentlig årsag til morbiditet og dødelighed hos patienter, der har gennemgået hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HSCT) [1]. I mave-tarmkanalen kan som et af hovedmålorganerne for GvHD-diagnose være vanskelig på grund af mange ensartede differentialdiagnoser, mest bemærkelsesværdige infektioner med cytomegalovirus [2]. Eksperter er uenige om den bedste diagnostiske tilgang til patienter, der mistænkes for akut gastrointestinal GvHD (aGI-GvHD). Der har været mange undersøgelser, der understøtter den endoskopiske evaluering af enten den nedre [3, 4, 5], den øvre [6, 7] eller begge dele af mave-tarmkanalen [8, 9]. I begge tilfælde tjener den histologiske evaluering af biopsiprøver som standardværktøj til at etablere den endelige diagnose [10].

I betragtning af den ret dårlige generelle tilstand hos patienter efter HSCT som en begrænsende faktor for endoskopisk og histologisk evaluering, er nogle nye tilgange blevet introduceret i den diagnostiske manual for aGI-GvHD for at reducere mængden af ​​invasive undersøgelser. Konventionelle billeddannelsesteknikker som magnetisk resonansbilleddannelse [11], computertomografi [12] og højopløsningsultralyd med Doppler-billeddannelse [13] rapporterede fortykkelse af tarmvæggen hos GvHD-patienter. Men da sådanne fund kun er uspecifikke tegn på gastrointestinal patologi, kan konventionelle billeddannelsesteknikker ikke erstatte endoskopi med biopsier [14]. Det samme gælder for videokapselendoskopi, som faktisk viste sig at have en høj negativ prædiktiv værdi for påvisning af aGI-GvHD, men deler den vigtige mangel ved manglende biopsiprøver til histologisk evaluering [15, 16, 17].

I det mindste flyttede denne metode fokus af interesse til tyndtarmen. Biopsier afledt af denne tidligere forsømte GI-del havde vist en høj følsomhed for GvHD-relaterede ændringer i tidligere undersøgelser [18]. Da lignende resultater blev set på undersøgelsesstedet, sammenlignede efterforskerne prospektivt enteroskopi med biopsier med den nuværende guldstandard i den diagnostiske aGI-GvHD-behandling, koloskopi med biopsier. I forbindelse med denne undersøgelse viste tyktarmen meget stærkere affekt af aGI-GvHD end alle andre steder, selvom der ikke var nogen undersøgelser, hvor koloskopi afslørede aGI-GvHD uden tilstedeværelsen af ​​sådanne fund ved enteroskopi. Tværtimod afslørede enteroskopi endda GvHD-relaterede patologier i et tilfælde, hvor den respektive koloskopi forblev upåfaldende. Følgelig postulerede de, at enteroskopiske fund kan erstatte behovet for koloskopi [19], hvorfor post-HSCT-patienter kunne forblive uden stressende tarmforberedelse, ofte begrænset af deres ret dårlige almentilstand.

En af de seneste udviklinger inden for endoskopisk behandling af mave-tarmkanalen er det såkaldte konfokale laserendomikroskop (CLE). Konfokal mikroskopi blev udviklet af Marvin Minsky i slutningen af ​​1950'erne. Dens princip er mikroskopisk scanning af brændpunkter under overfladen af ​​et objekt. I sammenligning med konventionel lysmikroskopi bruger den et specielt filtersystem for at undgå billedoverlapning af omgivende væv. I detaljer fokuseres en lyskilde (normalt en laser) af et mikroskopobjektiv til et diffraktionsbegrænset sted på eller inde i objektet. Lys, der er spredt, eller fluorescens exciteret (opnået gennem fluorescein-farvning, for eksempel) og udsendt, ved fokus i prøven vil delvist vende tilbage gennem optikken langs stien, hvorfra den ankom. En stråledeler placeret i banen reflekterer returlyset mod en detektor. Optikken vil fokusere lyset fra fokuspunktet i prøven til dets konjugerede fokus nær detektoren (derfor kaldes teknologien "konfokal"). Her bruges et rumligt filter ("pinhole") til at slukke alt lys, der kommer fra områder uden for brændpunktet. Lysrefleksioner fra selve brændpunktet vil blive videresendt til detektoren, som er forbundet til et computersystem, der digitaliserer det optiske signal og skaber det in vivo histologiske billede [20].

Med fokus på dens kliniske virkning er konfokal mikroskopi den første teknik, der muliggør in vivo-evaluering af vævsstrukturer under deres overflade. På grund af mange gennembrud inden for miniaturisering (mest i 1990'erne) kunne denne teknologi anvendes til intraluminal brug i gastroenterologi, integreret i et ellers standard endoskop. Det muliggør in vivo histologisk visualisering af de øverste 250 mikrometer af alle vægge i mave-tarmkanalen, ud over den normale funktion af hvidt lys endoskopi (tilvejebragt af to separate skærme oven på arbejdsstationen) [20].

Den første kliniske anvendelse af CLE i et prospektivt pilotforsøg med 35 patienter efter HSCT blev rapporteret af Bojarski et al. i 2009. CLE i tyktarmsslimhinden kunne forudsige den positive diagnose af aGI-GvHD hos 14 ud af 19 patienter, senere bekræftet ved histologisk evaluering. In vivo-fundene af aGI-GvHD, varierende fra enkelt kryptapoptose til fuldstændigt krypttab, kunne tydeligt skelnes fra patologier af anden oprindelse såsom infektiøs colitis eller ulcerøs colitis, begge brugt som sammenlignende kontrol [21].

Studiemål

I denne kliniske undersøgelse har efterforskerne til hensigt at fortsætte den diagnostiske tilgang til akut Gastrointestinal Graft-versus-Host Disease (aGI-GvHD). Baseret på de nylige resultater fra undersøgelsesinstitutionen (forklaret ovenfor, [19]), der viste et bemærkelsesværdigt diagnostisk udbytte for aGI-GvHD-associerede patologier i tyndtarmen, har efterforskerne til hensigt at evaluere konfokal laserendomikroskopi (CLE) af tyndtarmen som primær diagnostisk procedure hos patienter med mistanke om aGI-GvHD efter hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HSCT).

• Efterforskerne sigter mod at undersøge, om tidlig diagnose af aGI-GvHD i duodenum og jejunum kan opnås ved at evaluere endomikroskopiske træk.
• I sammenligning med konventionelle biopsier fra de nævnte GI-dele som guldstandard ønsker efterforskerne at teste, om de markører, der er beskrevet af Bojarski et al. for tyktarmen gælder også for tyndtarmen.
• Inklusive endomikroskopiske resultater af patienter med cøliaki, enterale infektioner, inflammatorisk tarmsygdom og raske forsøgspersoner som kontroller, sigter efterforskerne mod at etablere aGI-GvHD specifikke markører, der kan bruges til en "biopsi-fri" in vivo diagnose af aGI-GvHD.

Studere design

Prospektivt klinisk pilotforsøg uden randomisering eller blinding

Studiebefolkning

Patienter efter hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HSCT), som henvises til undersøgelsesstedet for afklaring af et af følgende symptomer:

• anoreksi
• kvalme
• opkastning
• mavesmerter
• diarré
• tarmblødning

For at udelukke mulige bivirkninger af konditioneringsterapien skal GI-symptomer være opstået eller varet ved 20 dage efter den respektive transplantationsdato [22].

Ekskluderingskriterier:

• infektion med CMV eller HSV
• bakteriel infektion i mave-tarmkanalen
• medicinrelaterede symptomer
• patienter, der er allergiske over for en af ​​lægemiddelkomponenterne (herunder lægemidler, der bruges til bevidst sedation som propofol eller midazolam samt fluorescein, det fluorescerende farvestof, der bruges til CLE)
• nægte at deltage i undersøgelsen
• patientens alder under 18 år.

Metoder

Denne undersøgelse vil blive udført på det medicinske universitet i Wien, afdeling for intern medicin III, afdeling for gastroenterologi og hepatologi. Patientrekruttering vil ske i tæt samarbejde med Institut for Intern Medicin I, Onkologisk Afdeling, Knoglemarvstransplantationsenhed.

Da denne undersøgelse er planlagt som et pilotforsøg, fokuserer den hovedsageligt på de kvalitative endomikroskopiske egenskaber af tyndtarmen hos GvHD-patienter for at give referencepatologier til præcis diagnose i fremtiden. Ikke desto mindre vil en kvantitativ analyse blive udført ved at sammenligne CLE-afledte diagnoser med histologiske resultater for at beregne sensitivitet og specificitet af CLE-baseret aGI-GvHD diagnose i tyndtarmen. I betragtning af det nuværende diagnostiske udbytte på 62 % for påvisning af aGI-GvHD hos symptomatiske post-HSCT-patienter ved konventionel histologi [19], anslog efterforskerne at inkludere 40 patienter med formodet aGI-GvHD for at opdage en meningsfuld prøve af patienter påvirket af aGI-GvHD til kvalitativ og kvantitativ analyse. Til sammenligning inkluderede Bojarski et al. 35 patienter, hvoraf 19 endelig viste sig at lide af aGI-GvHD ved konventionel histologi. De kunne derefter beregne en sensitivitet på 74 % og specificitet på 100 % for forudsigelsen af ​​den histologiske diagnose ved CLE [21]. På basis af den aktuelle hyppighed af post-HSCT-patienter på undersøgelsesstedet anslår efterforskerne at inkludere den tilsigtede mængde på 40 patienter inden for en tidsperiode på 2 år.

Alle patienter, der opfylder de anførte inklusionskriterier, vil modtage patientinformationsskemaet for denne undersøgelse sammen med den sædvanlige informerede samtykkeerklæring for den respektive endoskopiske undersøgelse, de skal gennemgå. Patientinformation vil ske mindst 24 timer før interventionen, som det praktiseres på vores afdeling. Hvis patienten indvilliger i at deltage i undersøgelsen, vil han/hun blive forberedt til endoskopi ved administration af intravenøs propofol og/eller midazolam, som rutinemæssigt anvendes til bevidst sedation under endoskopiske procedurer på vores afdeling. Derudover vil 5-10 ml af en 10 % opløsning af fluoresceinnatrium blive administreret intravenøst ​​for at øge vævsfluorescensen under endomikroskopi. Da der indtil videre ikke er noget specifikt CLE-enteroskop tilgængeligt, vil vi bruge CLE-koloskopet (Pentax EC-3870 CIFK med ISC-1000 konfokal endomikroskopi-processor - Pentax, Tokyo, Japan og Optiscan Pty Ltd, Notting Hill, Victoria, Australien) at nå tyndtarmen, sammenlignelig med en enteroskopisk procedure (oral adgang).

Alle lægemidler vil blive administreret af speciallæger, assistentlæger eller registrerede sygeplejersker, som det rutinemæssigt praktiseres på vores institution.

Optagelse af CLE-billeder starter på det dybeste punkt, der kan nås i jejunum. Under tilbagetrækning af skopet vil der blive taget CLE-billeder hver 10. centimeter i tyndtarmen, derefter fra antrum og krop af maven og fra spiserøret. Ydermere vil CLE blive anvendt til områder, der ser forskellige ud, mistænkelige for patologisk oprindelse. Uanset hvor der tages CLE-billeder, vil der blive taget en konventionel biopsi fra den samme lokalisering.

CLE billeder vil blive optaget og gemt rutinemæssigt ved hjælp af vores standard data management system. De vil blive evalueret umiddelbart efter den endoskopiske procedure sammen med en bestyrelsescertificeret GI-patolog, som vil etablere en indledende diagnose.

Konventionelle biopsier vil blive farvet med Haematoxylin & Eosin, samt PAS-farve. In-situ hybridisering for CMV og HSV vil blive udført for at udelukke viral infektion. Klassificering af GvHD vil blive udført i henhold til McDonald og Salg i 4 kvaliteter, passende modificeret til tyndtarmen [23]:

• Grad I: individuel celle nekrose
• Grad II: kryptabscess
• Grad III: fald ud af en eller flere hele krypter i en biopsi
• Grad IV: total denudation af epitel

Endomikroskopiske kontroller (patienter med cøliaki, enterale infektioner, inflammatorisk tarmsygdom og raske forsøgspersoner) vil blive indsamlet fra nuværende data om endomikroskopiske procedurer, der allerede er udført inden for rutineundersøgelser.

Ved afslutningen af ​​undersøgelsen vil alle CLE-billeder og histologiske udskæringer blive evalueret separat af to blindede bord-certificerede patologer. I tilfælde af uoverensstemmende diagnoser vil de sammen analysere de respektive tilfælde for at nå til enighed om den endelige diagnose. Alle tilfælde, hvor den indledende og den endelige diagnose afviger fra hinanden, vil blive revurderet sammen af ​​alle involverede specialister.

Risiko/fordele vurdering

GvHD repræsenterer en væsentlig årsag til morbiditet og dødelighed efter allogen HSCT. Cirka 10-40% af patienter, der gennemgår HSCT, udvikler signifikant GvHD, og ​​omkring halvdelen af ​​disse patienter dør af denne sygdom eller af terapi resulterende komplikationer [1].

Endoskopiske procedurer hos patienter med mistanke om aGI-GvHD er veletablerede. Indtil nu er den histologiske evaluering af GI-afledte biopsier guldstandardværktøjet til at sætte en nøjagtig aGI-GvHD-diagnose. Endoskopi af den øvre GI-kanal er mere behagelig end den endoskopiske vurdering af den nedre GI-kanal, da der ikke er behov for tarmforberedelse. Derfor er det den primære teknik til at vurdere post HSCT patienter på vores afdeling. Understøttet af nylige resultater ved undersøgelsesinstitutionen [19] udføres disse øvre GI-endoskopier rutinemæssigt som enteroskopier i stedet for gastroskopier for at inkludere tyndtarmen i den diagnostiske evaluering. Sikkerheden ved enteroskopi er ikke blevet undersøgt systematisk, men rapporteret erfaring er betydelig, og komplikationer har været sjældne [24].

Konfokal laserendomikroskopi er en sikker ny teknik, som allerede er blevet undersøgt i kliniske forsøg [25, 26]. Dets sikkerhed garanteres ved brugen af ​​laserlys med lav intensitet, der i værste fald kan forårsage lokal blegning af fluoresceinholdige celler, hvilket er uskadeligt, reversibelt og endda bruges som diagnostisk tegn under eksperimentelle forhold [20].

Etiske implikationer

Denne undersøgelsesprotokol blev godkendt af den etiske kommission for det medicinske universitet i Wien.

Alle procedurer i forbindelse med denne undersøgelse vil blive udført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen samt retningslinjerne for god videnskabelig praksis (GSP) fra det medicinske universitet i Wien.

Forventet effekt og Outlook

Hvis efterforskerne finder aGI-GvHD-specifikke markører, der kan bruges til en "biopsi-fri" in vivo-diagnose af aGI-GvHD, kan dette føre til endnu en reduktion af invasive procedurer for patienter efter HSCT. Dette ville have en stor klinisk effekt, da biopsivurdering ofte er begrænset af denne patientgruppes dårlige koagulationsstatus.

Hvis de ikke klart kan bestemme specifikke markører for aGI-GvHD, bør CLE i det mindste reducere mængden af ​​konventionelle biopsier, der er nødvendige til diagnosticering, ved at tage dem under CLE-vejledning.

På trods af den forventede reduktion af invasive procedurer kan aGI-GvHD-diagnose in vivo føre til øjeblikkelig påbegyndelse af immunsuppressiv behandling for at reducere progression og spredning af sygdommen.

I tilfælde af at studiets mål vil blive understøttet af resultaterne af dette pilotforsøg, vil der blive udført et randomiseret kontrolleret forsøg, der sammenligner in vivo diagnose med konventionel histologisk vurdering i spørgsmål om hospitalsindlæggelse og overlevelse.