Endomikroskopia i choroba przeszczep przeciw gospodarzowi

Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD) stanowi główną przyczynę zachorowalności i śmiertelności u pacjentów poddanych przeszczepianiu hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCT) [1]. W przewodzie pokarmowym jako jednym z głównych narządów docelowych GvHD diagnostyka może być trudna ze względu na wiele podobnych do siebie różnicowych rozpoznań, z których najbardziej zauważalną jest infekcja wirusem cytomegalii [2]. Eksperci nie są zgodni co do najlepszego podejścia diagnostycznego dla pacjentów z podejrzeniem ostrej GvHD przewodu pokarmowego (aGI-GvHD). Istnieje wiele badań wspierających endoskopową ocenę dolnego [3, 4, 5], górnego [6, 7] lub obu odcinków przewodu pokarmowego [8, 9]. W obu przypadkach ocena histologiczna próbek pobranych z biopsji służy jako standardowe narzędzie do ustalenia ostatecznego rozpoznania [10].

Biorąc pod uwagę dość zły stan ogólny pacjentów po HSCT jako czynnik ograniczający ocenę endoskopową i histologiczną, w podręczniku diagnostycznym aGI-GvHD wprowadzono kilka nowych podejść w celu zmniejszenia ilości badań inwazyjnych. Konwencjonalne techniki obrazowania, takie jak rezonans magnetyczny [11], tomografia komputerowa [12] i ultrasonografia wysokiej rozdzielczości z obrazowaniem dopplerowskim [13], wykazały pogrubienie ściany jelita u pacjentów z GvHD. Ale ponieważ takie wyniki są jedynie nieswoistymi objawami patologii przewodu pokarmowego, konwencjonalne techniki obrazowania nie mogą zastąpić endoskopii biopsjami [14]. To samo dotyczy endoskopii kapsułek wideo, która rzeczywiście ma wysoką ujemną wartość predykcyjną dla wykrycia aGI-GvHD, ale ma ważną wadę brakujących próbek biopsji do oceny histologicznej [15, 16, 17].

Przynajmniej ta metoda przeniosła punkt ciężkości zainteresowania na jelito cienkie. Biopsje pochodzące z tej dawniej zaniedbanej części przewodu pokarmowego wykazywały we wcześniejszych badaniach wysoką czułość zmian związanych z GvHD [18]. Ponieważ podobne wyniki zaobserwowano w ośrodku badawczym, badacze prospektywnie porównali enteroskopię z biopsjami do obecnego złotego standardu w diagnostyce zarządzania aGI-GvHD, kolonoskopii z biopsjami. W kontekście tego badania jelito grube wykazywało znacznie silniejsze zajęcie przez aGI-GvHD niż wszystkie inne lokalizacje, chociaż nie było pary badań, w których kolonoskopia ujawniła aGI-GvHD bez obecności takich wyników w enteroskopii. Wręcz przeciwnie, enteroskopia ujawniła nawet patologie związane z GvHD w jednym przypadku, w którym odpowiednia kolonoskopia pozostała niepozorna. W konsekwencji postulowali, że wyniki badania enteroskopowego mogą zastąpić konieczność kolonoskopii [19], dzięki czemu pacjenci po HSCT mogą pozostać bez stresującego przygotowania jelita, często ograniczonego raczej złym stanem ogólnym.

Jednym z najnowszych osiągnięć w endoskopowym leczeniu przewodu pokarmowego jest tzw. laserowy endomikroskop konfokalny (CLE). Mikroskopia konfokalna została opracowana przez Marvina Minsky'ego pod koniec lat pięćdziesiątych. Jego zasadą jest mikroskopowe skanowanie ognisk znajdujących się pod powierzchnią obiektu. W porównaniu z konwencjonalną mikroskopią świetlną wykorzystuje specjalny system filtrów, aby uniknąć nakładania się obrazu przez otaczającą tkankę. Mówiąc szczegółowo, źródło światła (zwykle laser) jest ogniskowane przez obiektyw mikroskopu w punkcie o ograniczonej dyfrakcji na lub wewnątrz obiektu. Światło rozproszone lub wzbudzone fluorescencją (uzyskane na przykład poprzez barwienie fluoresceiną) i wyemitowane w ognisku w próbce częściowo powróci przez optykę wzdłuż ścieżki, z której przybyło. Rozdzielacz wiązki umieszczony na ścieżce odbija światło powrotne w kierunku detektora. Optyka skupi światło od ogniska w próbce do ogniska koniugatu w pobliżu detektora (stąd technologia nazywana jest „konogniskową”). Tutaj filtr przestrzenny („otworek”) jest używany do gaszenia całego światła pochodzącego z obszarów poza ogniskiem. Odbicia światła od samego ogniska będą przekazywane do detektora, który jest podłączony do systemu komputerowego digitalizującego sygnał optyczny i tworzącego obraz histologiczny in vivo [20].

Koncentrując się na jej wpływie klinicznym, mikroskopia konfokalna jest pierwszą techniką umożliwiającą ocenę in vivo struktur tkankowych pod ich powierzchnią. Dzięki wielu przełomom w miniaturyzacji (głównie w latach 90. XX wieku) technologia ta mogła zostać zastosowana do światła przewodu pokarmowego w gastroenterologii, zintegrowana ze standardowym endoskopem. Pozwala na histologiczną wizualizację in vivo górnych 250 mikrometrów wszystkich ścian przewodu pokarmowego, dodatkowo do normalnej funkcji endoskopii w świetle białym (zapewnianej przez dwa oddzielne ekrany na górze stacji roboczej) [20].

Pierwsze kliniczne zastosowanie CLE w prospektywnym badaniu pilotażowym obejmującym 35 pacjentów po HSCT opisali Bojarski i wsp. w 2009. CLE błony śluzowej okrężnicy może przewidywać pozytywne rozpoznanie aGI-GvHD u ​​14 z 19 pacjentów, co zostało później potwierdzone w ocenie histologicznej. Odkrycia in vivo aGI-GvHD, od apoptozy pojedynczej krypty do całkowitej utraty krypty, były wyraźnie odróżnialne od patologii innego pochodzenia, takich jak zakaźne zapalenie jelita grubego lub wrzodziejące zapalenie jelita grubego, oba stosowane jako kontrola porównawcza [21].

Cele studiów

W tym badaniu klinicznym badacze zamierzają kontynuować podejście diagnostyczne w przypadku ostrej choroby przeszczep przeciw gospodarzowi (aGI-GvHD) w przewodzie pokarmowym. W oparciu o ostatnie wyniki uzyskane w instytucji badawczej (wyjaśnione powyżej, [19]), które wykazały niezwykłą wydajność diagnostyczną patologii związanych z aGI-GvHD w jelicie cienkim, badacze zamierzają ocenić konfokalną laserową endomikroskopię (CLE) jelita cienkiego jako pierwotną postępowanie diagnostyczne u pacjentów z podejrzeniem aGI-GvHD po przeszczepie hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCT).

• Badacze mają na celu zbadanie, czy wczesne rozpoznanie aGI-GvHD w dwunastnicy i jelicie czczym można osiągnąć poprzez ocenę cech endomikroskopowych.
• W porównaniu z konwencjonalnymi biopsjami wspomnianych części przewodu pokarmowego jako złotym standardem badacze chcą sprawdzić, czy markery opisane przez Bojarskiego i in. dla okrężnicy odnoszą się również do jelita cienkiego.
• Uwzględniając wyniki badań endomikroskopowych pacjentów z celiakią, infekcjami jelitowymi, nieswoistymi zapaleniami jelit i zdrowych osobników jako grupy kontrolnej, badacze dążą do ustalenia swoistych markerów aGI-GvHD, które można wykorzystać do „bez biopsji” diagnozy aGI-GvHD in vivo.

Projekt badania

Prospektywne kliniczne badanie pilotażowe bez randomizacji i zaślepienia

Badana populacja

Pacjenci po przeszczepie hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCT), którzy są kierowani do ośrodka badawczego w celu wyjaśnienia jednego z następujących objawów:

• anoreksja
• mdłości
• wymioty
• ból brzucha
• biegunka
• krwawienie z jelit

Aby wykluczyć możliwe skutki uboczne terapii kondycjonującej, objawy ze strony przewodu pokarmowego muszą wystąpić lub utrzymywać się 20 dni po odpowiedniej dacie przeszczepu [22].

Kryteria wyłączenia:

• zakażenie wirusem CMV lub HSV
• infekcja bakteryjna przewodu pokarmowego
• objawy związane z lekami
• pacjenci uczuleni na jeden ze składników leku (w tym leki stosowane w celu uspokojenia świadomości, takie jak propofol lub midazolam oraz fluoresceina, barwnik fluorescencyjny stosowany w CLE)
• odmowa udziału w badaniu
• wiek pacjenta poniżej 18 lat.

Metody

Badanie to zostanie przeprowadzone na Uniwersytecie Medycznym w Wiedniu, III Klinice Chorób Wewnętrznych, Oddział Gastroenterologii i Hepatologii. Rekrutacja pacjentów będzie prowadzona w ścisłej współpracy z Oddziałem Chorób Wewnętrznych I Oddziału Onkologii Oddziału Transplantacji Szpiku.

Ponieważ badanie to zostało zaplanowane jako próba pilotażowa, koncentruje się głównie na jakościowych cechach endomikroskopowych jelita cienkiego u pacjentów z GvHD, aby uzyskać referencyjne patologie dla dokładnej diagnozy w przyszłości. Niemniej jednak zostanie przeprowadzona analiza ilościowa poprzez porównanie diagnoz pochodzących z CLE z wynikami histologicznymi w celu obliczenia czułości i swoistości diagnozy aGI-GvHD opartej na CLE w jelicie cienkim. Biorąc pod uwagę obecną wydajność diagnostyczną wynoszącą 62% w wykrywaniu aGI-GvHD u ​​objawowych pacjentów po HSCT za pomocą konwencjonalnej histologii [19], badacze oszacowali, że w celu odkrycia znaczącej próby pacjentów uwzględniono 40 pacjentów z podejrzeniem aGI-GvHD dotkniętych przez aGI-GvHD do analizy jakościowej i ilościowej. Dla porównania, Bojarski i wsp. obejmowali 35 pacjentów, z których 19 ostatecznie okazało się cierpieć na aGI-GvHD według konwencjonalnej histologii. Mogli wtedy obliczyć czułość 74% i swoistość 100% dla przewidywania rozpoznania histologicznego na podstawie CLE [21]. Na podstawie aktualnej częstotliwości pacjentów po HSCT w ośrodku badawczym badacze szacują, że w ciągu 2 lat obejmie docelową liczbę 40 pacjentów.

Wszyscy pacjenci, którzy spełniają wymienione kryteria włączenia, otrzymają formularz informacyjny dla pacjenta dotyczący tego badania wraz ze zwykłym formularzem świadomej zgody na odpowiednie badanie endoskopowe, któremu mają zostać poddani. Informacje o pacjencie zostaną podane co najmniej 24 godziny przed interwencją, zgodnie z praktyką w naszym oddziale. Jeśli pacjent wyrazi zgodę na udział w badaniu, zostanie przygotowany do endoskopii poprzez dożylne podanie propofolu i/lub midazolamu, tak jak rutynowo stosuje się je do świadomej sedacji podczas zabiegów endoskopowych na naszym oddziale. Dodatkowo podaje się dożylnie 5-10 ml 10% roztworu soli sodowej fluoresceiny w celu wzmocnienia fluorescencji tkanek podczas endomikroskopii. Ponieważ jak dotąd nie jest dostępny żaden konkretny enteroskop CLE, użyjemy kolonoskopu CLE (Pentax EC-3870 CIFK z procesorem endomikroskopii konfokalnej ISC-1000 - Pentax, Tokio, Japonia i Optiscan Pty Ltd, Notting Hill, Victoria, Australia) dotrzeć do jelita cienkiego, porównywalne z procedurą enteroskopową (dostęp przez usta).

Wszystkie leki będą podawane przez lekarzy specjalistów, asystentów lekarskich lub dyplomowane pielęgniarki, zgodnie z rutynową praktyką w naszej placówce.

Przechwytywanie obrazu CLE rozpocznie się w najgłębszym dostępnym punkcie jelita czczego. W czasie cofnięcia endoskopu zdjęcia CLE będą wykonywane co 10 centymetrów w jelicie cienkim, następnie z antrum i trzonu żołądka oraz z przełyku. Ponadto CLE będzie stosowane w przypadku wyraźnie wyglądających obszarów, podejrzanych o patologiczne pochodzenie. Wszędzie tam, gdzie uzyskiwane są obrazy CLE, konwencjonalna biopsja zostanie pobrana z tej samej lokalizacji.

Obrazy CLE będą rutynowo rejestrowane i przechowywane przy użyciu naszego standardowego systemu zarządzania danymi. Zostaną one ocenione bezpośrednio po zabiegu endoskopowym wraz z certyfikowanym przez komisję patologiem przewodu pokarmowego, który ustali wstępną diagnozę.

Konwencjonalne biopsje będą barwione hematoksyliną i eozyną, a także barwnikiem PAS. Hybrydyzacja in situ dla CMV i HSV zostanie przeprowadzona w celu wykluczenia infekcji wirusowej. Klasyfikacja GvHD zostanie przeprowadzona według McDonalda i Sale'a w 4 stopniach, odpowiednio zmodyfikowanych dla jelita cienkiego [23]:

• Stopień I: martwica pojedynczych komórek
• Stopień II: ropień krypty
• Stopień III: wypadanie z jednej lub więcej całych krypt podczas biopsji
• Stopień IV: całkowite obnażenie nabłonka

Kontrole endomikroskopowe (pacjenci z celiakią, infekcjami jelitowymi, nieswoistymi zapaleniami jelit oraz osoby zdrowe) będą zbierane na podstawie aktualnych danych z zabiegów endomikroskopowych wykonanych już w ramach rutynowych badań.

Na koniec badania wszystkie obrazy CLE i wycinki histologiczne zostaną ocenione oddzielnie przez dwóch certyfikowanych patologów z zaślepioną płytą. W przypadku rozbieżnych diagnoz wspólnie przeanalizują poszczególne przypadki, aby dojść do porozumienia w sprawie ostatecznej diagnozy. Wszystkie przypadki, w których początkowa i ostateczna diagnoza odbiegają od siebie, zostaną wspólnie ponownie ocenione przez wszystkich zaangażowanych specjalistów.

Ocena ryzyka i korzyści

GvHD stanowi główną przyczynę zachorowalności i śmiertelności po allogenicznym HSCT. U około 10-40% pacjentów poddawanych HSCT rozwija się znaczna GvHD, a około połowa z nich umiera z powodu tej choroby lub powikłań wynikających z terapii [1].

Procedury endoskopowe u pacjentów z podejrzeniem aGI-GvHD są dobrze ugruntowane. Do tej pory histologiczna ocena biopsji pochodzących z przewodu pokarmowego jest złotym standardowym narzędziem do ustalenia dokładnej diagnozy aGI-GvHD. Endoskopia górnego odcinka przewodu pokarmowego jest wygodniejsza niż endoskopowa ocena dolnego odcinka przewodu pokarmowego, ponieważ nie wymaga przygotowania jelita. Dlatego jest to podstawowa technika oceny pacjentów po HSCT na naszym oddziale. Poparte ostatnimi wynikami uzyskanymi w ośrodku badawczym [19], te endoskopie górnego odcinka przewodu pokarmowego są rutynowo wykonywane jako enteroskopia zamiast gastroskopii w celu włączenia jelita cienkiego do oceny diagnostycznej. Bezpieczeństwo enteroskopii nie było systematycznie badane, ale zgłaszane doświadczenia są znaczne, a powikłania są rzadkie [24].

Laserowa endomikroskopia konfokalna jest nową, bezpieczną techniką, która została już przebadana w badaniach klinicznych [25, 26]. Jej bezpieczeństwo gwarantuje zastosowanie światła laserowego o niskim natężeniu, które w najgorszym przypadku może spowodować miejscowe wybielenie komórek zawierających fluoresceinę, co jest nieszkodliwe, odwracalne, a nawet stosowane jako znak diagnostyczny w warunkach eksperymentalnych [20].

Implikacje etyczne

Ten protokół badania został zatwierdzony przez komisję etyczną Uniwersytetu Medycznego w Wiedniu.

Wszystkie procedury w kontekście tego badania będą wykonywane zgodnie z Deklaracją Helsińską oraz wytycznymi Dobrej Praktyki Naukowej (GSP) Uniwersytetu Medycznego w Wiedniu.

Oczekiwany wpływ i perspektywy

Jeśli badacze znajdą specyficzne markery aGI-GvHD, które można wykorzystać do „bez biopsji” diagnozy aGI-GvHD in vivo, może to doprowadzić do kolejnego ograniczenia inwazyjnych procedur u pacjentów po HSCT. Miałoby to duże znaczenie kliniczne, ponieważ ocena biopsji jest często ograniczona przez zły stan krzepnięcia tej grupy pacjentów.

W przypadku, gdy nie mogą jednoznacznie określić specyficznych markerów aGI-GvHD, CLE powinno przynajmniej zmniejszyć liczbę konwencjonalnych biopsji potrzebnych do postawienia diagnozy, biorąc je pod wytyczne CLE.

Pomimo spodziewanego ograniczenia procedur inwazyjnych, diagnostyka aGI-GvHD in vivo może prowadzić do natychmiastowego rozpoczęcia leczenia immunosupresyjnego w celu ograniczenia progresji i rozprzestrzeniania się choroby.

Jeśli cele badania zostaną poparte wynikami tego badania pilotażowego, zostanie przeprowadzone randomizowane badanie kontrolowane porównujące diagnostykę in vivo z konwencjonalną oceną histologiczną w zakresie hospitalizacji i przeżycia.