Endomikroskopie und Graft-versus-Host-Disease

Die Graft-versus-Host-Disease (GvHD) stellt eine Hauptursache für Morbidität und Mortalität bei Patienten dar, die sich einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSZT) unterzogen haben [1]. Im Gastrointestinaltrakt als einem der Hauptzielorgane der GvHD kann die Diagnose aufgrund vieler ähnlicher Differenzialdiagnosen schwierig sein, insbesondere Infektionen durch Cytomegalovirus [2]. Experten sind sich uneinig über das beste diagnostische Vorgehen bei Patienten mit Verdacht auf akute gastrointestinale GvHD (aGI-GvHD). Es gibt viele Studien, die die endoskopische Beurteilung entweder des unteren [3, 4, 5], des oberen [6, 7] oder beider Teile des Gastrointestinaltrakts unterstützen [8, 9]. In beiden Fällen dient die histologische Auswertung von Biopsieproben als Standardinstrument zur Erstellung der endgültigen Diagnose [10].

In Anbetracht des eher schlechten Allgemeinzustandes der Patienten nach HSZT als limitierendem Faktor für die endoskopische und histologische Abklärung wurden einige neue Ansätze in das Diagnostikmanual der aGI-GvHD aufgenommen, um die Anzahl der invasiven Untersuchungen zu reduzieren. Herkömmliche bildgebende Verfahren wie Magnetresonanztomographie [11], Computertomographie [12] und hochauflösender Ultraschall mit Doppler-Bildgebung [13] berichteten über eine Darmwandverdickung bei GvHD-Patienten. Da solche Befunde aber nur unspezifische Zeichen einer gastrointestinalen Pathologie sind, können herkömmliche bildgebende Verfahren die Endoskopie mit Biopsien nicht ersetzen [14]. Gleiches gilt für die Videokapselendoskopie, die zwar einen hohen negativen prädiktiven Wert für den Nachweis einer aGI-GvHD hat, aber das wichtige Manko fehlender Biopsieproben für die histologische Auswertung teilt [15, 16, 17].

Zumindest verlagerte diese Methode den Fokus des Interesses auf den Dünndarm. Biopsien aus diesem ehemals vernachlässigten GI-Teil hatten in früheren Studien eine hohe Sensitivität für GvHD-bedingte Veränderungen gezeigt [18]. Da am Studienort ähnliche Ergebnisse erzielt wurden, verglichen die Forscher prospektiv die Enteroskopie mit Biopsien mit dem derzeitigen Goldstandard im diagnostischen aGI-GvHD-Management, der Koloskopie mit Biopsien. Im Rahmen dieser Untersuchung zeigte sich der Dickdarm deutlich stärker von aGI-GvHD betroffen als alle anderen Lokalisationen, obwohl es kein Untersuchungspaar gab, bei dem bei der Koloskopie eine aGI-GvHD festgestellt wurde, ohne dass ein solcher Befund bei der Enteroskopie vorlag. Ganz im Gegenteil, die Enteroskopie zeigte in einem Fall sogar GvHD-bedingte Pathologien, bei denen die entsprechende Darmspiegelung unauffällig blieb. Folglich postulierten sie, dass enteroskopische Befunde die Notwendigkeit einer Koloskopie ersetzen könnten [19], weshalb Patienten nach HSZT ohne belastende Darmvorbereitung bleiben könnten, oft eingeschränkt durch ihren eher schlechten Allgemeinzustand.

Eine der neuesten Entwicklungen im endoskopischen Management des Magen-Darm-Traktes ist das sogenannte konfokale Laser-Endomikroskop (CLE). Die konfokale Mikroskopie wurde Ende der 1950er Jahre von Marvin Minsky entwickelt. Sein Prinzip ist das mikroskopische Abtasten von Brennpunkten unter der Oberfläche eines Objekts. Im Vergleich zur konventionellen Lichtmikroskopie verwendet es ein spezielles Filtersystem, um Bildüberlagerungen durch umgebendes Gewebe zu vermeiden. Genauer gesagt wird eine Lichtquelle (normalerweise ein Laser) durch eine Mikroskopobjektivlinse auf einen beugungsbegrenzten Fleck auf oder innerhalb des Objekts fokussiert. Licht, das im Fokus in der Probe gestreut oder fluoreszenzerregt (z. B. durch Fluorescein-Färbung erreicht) und emittiert wird, kehrt teilweise durch die Optik auf dem Weg zurück, von dem es gekommen ist. Ein in den Pfad eingesetzter Strahlteiler reflektiert das zurückkommende Licht zu einem Detektor. Die Optik fokussiert das Licht vom Brennpunkt in der Probe zu seinem konjugierten Fokus in der Nähe des Detektors (daher wird die Technologie als "konfokal" bezeichnet). Hier wird ein Raumfilter ("Pinhole") verwendet, um alles Licht auszulöschen, das von Bereichen außerhalb des Brennpunkts stammt. Lichtreflexionen vom Brennpunkt selbst werden an den Detektor weitergeleitet, der mit einem Computersystem verbunden ist, das das optische Signal digitalisiert und das histologische In-vivo-Bild erstellt [20].

Die konfokale Mikroskopie konzentriert sich auf ihre klinische Bedeutung und ist die erste Technik, die eine In-vivo-Bewertung von Gewebestrukturen unter ihrer Oberfläche ermöglicht. Aufgrund vieler Durchbrüche bei der Miniaturisierung (hauptsächlich in den 1990er Jahren) konnte diese Technologie für den intraluminalen Einsatz in der Gastroenterologie angewendet werden, integriert in ein ansonsten standardmäßiges Endoskop. Es ermöglicht die histologische In-vivo-Visualisierung der oberen 250 Mikrometer aller Wände im Magen-Darm-Trakt, zusätzlich zur normalen Funktion der Weißlicht-Endoskopie (bereitgestellt durch zwei separate Bildschirme auf der Oberseite der Arbeitsstation) [20].

Die erste klinische Anwendung von CLE in einer prospektiven Pilotstudie mit 35 Patienten nach HSZT wurde von Bojarski et al. in 2009. CLE der Kolonschleimhaut konnte bei 14 von 19 Patienten die positive Diagnose einer aGI-GvHD vorhersagen, die später durch histologische Auswertung bestätigt wurde. Die In-vivo-Befunde von aGI-GvHD, die von der Apoptose einzelner Krypten bis zum vollständigen Verlust der Krypten reichten, waren klar von Pathologien anderer Genese wie infektiöser Kolitis oder Colitis ulcerosa zu unterscheiden, die beide als Vergleichskontrolle verwendet wurden [21].

Studienziele

In dieser klinischen Prüfung beabsichtigen die Prüfärzte, den diagnostischen Ansatz für die akute gastrointestinale Graft-versus-Host-Erkrankung (aGI-GvHD) fortzusetzen. Basierend auf den jüngsten Ergebnissen an der Studieninstitution (oben erläutert, [19]), die eine bemerkenswerte diagnostische Ausbeute für aGI-GvHD-assoziierte Pathologien im Dünndarm zeigten, beabsichtigen die Forscher, die konfokale Laser-Endomikroskopie (CLE) des Dünndarms als primär zu evaluieren diagnostisches Vorgehen bei Patienten mit Verdacht auf aGI-GvHD nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT).

• Die Forscher wollen untersuchen, ob eine frühzeitige Diagnose einer aGI-GvHD im Zwölffingerdarm und Jejunum durch die Auswertung endomikroskopischer Merkmale erreicht werden kann.
• Im Vergleich zu konventionellen Biopsien aus den genannten GI-Teilen als Goldstandard wollen die Forscher testen, ob die von Bojarski et al. für den Dickdarm gelten auch für den Dünndarm.
• Einschließlich endomikroskopischer Ergebnisse von Patienten mit Zöliakie, enteralen Infektionen, entzündlichen Darmerkrankungen und gesunden Probanden als Kontrollpersonen wollen die Forscher aGI-GvHD-spezifische Marker etablieren, die für eine „biopsiefreie“ In-vivo-Diagnose von aGI-GvHD verwendet werden können.

Studiendesign

Prospektive klinische Pilotstudie ohne Randomisierung oder Verblindung

Studienpopulation

Patienten nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT), die zur Abklärung eines der folgenden Symptome an das Studienzentrum überwiesen werden:

• Anorexie
• Brechreiz
• Erbrechen
• Bauchschmerzen
• Durchfall
• Darmblutungen

Um mögliche Nebenwirkungen der Konditionierungstherapie auszuschließen, müssen GI-Symptome 20 Tage nach dem jeweiligen Transplantationsdatum aufgetreten oder persistiert sein [22].

Ausschlusskriterien:

• Infektion mit CMV oder HSV
• bakterielle Infektion des Magen-Darm-Traktes
• medikamentenbedingte Symptome
• Patienten, die allergisch gegen einen der Bestandteile des Arzneimittels sind (einschließlich Arzneimittel zur bewussten Sedierung wie Propofol oder Midazolam sowie Fluorescein, der für CLE verwendete Fluoreszenzfarbstoff)
• Weigerung, an der Studie teilzunehmen
• Alter des Patienten unter 18 Jahren.

Methoden

Diese Untersuchung wird an der Medizinischen Universität Wien, Universitätsklinik für Innere Medizin III, Klinische Abteilung für Gastroenterologie und Hepatologie durchgeführt. Die Patientenrekrutierung erfolgt in enger Zusammenarbeit mit der Klinik für Innere Medizin I, Klinische Abteilung für Onkologie, Abteilung Knochenmarktransplantation.

Da diese Studie als Pilotstudie geplant ist, konzentriert sie sich hauptsächlich auf die qualitativen endomikroskopischen Merkmale des Dünndarms bei GvHD-Patienten, um Referenzpathologien für eine genaue Diagnose in der Zukunft zu liefern. Dennoch wird eine quantitative Analyse durchgeführt, indem CLE-abgeleitete Diagnosen mit histologischen Ergebnissen verglichen werden, um die Sensitivität und Spezifität der CLE-basierten aGI-GvHD-Diagnose im Dünndarm zu berechnen. In Anbetracht der aktuellen diagnostischen Ausbeute von 62 % für den Nachweis einer aGI-GvHD bei symptomatischen Post-HSZT-Patienten durch konventionelle Histologie [19] schätzten die Forscher, dass 40 Patienten mit Verdacht auf aGI-GvHD eingeschlossen werden, um eine aussagekräftige Patientengruppe zu entdecken von aGI-GvHD betroffen sind, zur qualitativen und quantitativen Analyse. Im Vergleich dazu schlossen Bojarski et al. 35 Patienten ein, von denen sich schließlich 19 mittels konventioneller Histologie als aGI-GvHD herausstellten. Sie konnten dann eine Sensitivität von 74 % und eine Spezifität von 100 % für die Vorhersage der histologischen Diagnose durch CLE berechnen [21]. Aufgrund der aktuellen Frequenz von Post-HSZT-Patienten am Studienzentrum schätzen die Prüfärzte die angestrebte Anzahl von 40 Patienten innerhalb eines Zeitraums von 2 Jahren ein.

Alle Patienten, die die aufgeführten Einschlusskriterien erfüllen, erhalten den Patienteninformationsbogen dieser Studie zusammen mit der üblichen Einwilligungserklärung der jeweiligen endoskopischen Untersuchung, der sie sich unterziehen werden. Die Patientenaufklärung erfolgt, wie in unserer Abteilung üblich, mindestens 24 Stunden vor dem Eingriff. Wenn der Patient der Teilnahme an der Studie zustimmt, wird er/sie auf die Endoskopie durch Verabreichung von intravenösem Propofol und/oder Midazolam vorbereitet, wie es routinemäßig zur bewussten Sedierung während endoskopischer Eingriffe in unserer Abteilung verwendet wird. Zusätzlich werden 5-10 ml einer 10%igen Lösung von Fluorescein-Natrium intravenös verabreicht, um die Gewebefluoreszenz während der Endomikroskopie zu verstärken. Da bisher kein spezifisches CLE-Enteroskop verfügbar ist, verwenden wir das CLE-Kolonoskop (Pentax EC-3870 CIFK mit dem konfokalen Endomikroskopie-Prozessor ISC-1000 – Pentax, Tokyo, Japan und Optiscan Pty Ltd, Notting Hill, Victoria, Australien) den Dünndarm zu erreichen, vergleichbar mit einem enteroskopischen Eingriff (oraler Zugang).

Alle Medikamente werden von Fachärzten, Assistenzärzten oder diplomierten Pflegekräften verabreicht, wie es in unserer Einrichtung routinemäßig praktiziert wird.

Die CLE-Bildaufnahme beginnt am tiefsten erreichbaren Punkt im Jejunum. Beim Zurückziehen des Endoskops werden CLE-Bilder alle 10 Zentimeter im Dünndarm, dann vom Antrum und Magenkörper und von der Speiseröhre aufgenommen. Darüber hinaus wird CLE auf deutlich aussehende Bereiche angewendet, die pathologischen Ursprungs verdächtig sind. Überall dort, wo CLE-Bilder erhalten werden, wird eine konventionelle Biopsie an derselben Stelle entnommen.

CLE-Bilder werden routinemäßig mit unserem Standard-Datenverwaltungssystem erfasst und gespeichert. Sie werden unmittelbar nach dem endoskopischen Eingriff zusammen mit einem staatlich geprüften GI-Pathologen untersucht, der eine erste Diagnose stellt.

Herkömmliche Biopsien werden mit Hämatoxylin & Eosin sowie mit PAS-Färbung gefärbt. Eine In-situ-Hybridisierung für CMV und HSV wird durchgeführt, um eine virale Infektion auszuschließen. Die Einteilung der GvHD erfolgt nach McDonald und Sale in 4 Grade, entsprechend modifiziert für den Dünndarm [23]:

• Grad I: Einzelzellnekrose
• Grad II: Kryptenabszess
• Grad III: Verlust einer oder mehrerer ganzer Krypten bei einer Biopsie
• Grad IV: totale Denudation des Epithels

Endomikroskopische Kontrollen (Patienten mit Zöliakie, enteralen Infektionen, entzündlichen Darmerkrankungen und gesunde Probanden) werden aus den vorliegenden Daten von bereits durchgeführten endomikroskopischen Verfahren im Rahmen von Routineuntersuchungen erhoben.

Am Ende der Studie werden alle CLE-Bilder und histologischen Schnitte separat von zwei verblindeten, staatlich geprüften Pathologen ausgewertet. Bei widersprüchlichen Diagnosen werden sie die jeweiligen Fälle gemeinsam analysieren, um eine Einigung über die endgültige Diagnose zu erzielen. Alle Fälle, in denen Erst- und Schlussdiagnose voneinander abweichen, werden von allen beteiligten Fachärzten gemeinsam neu bewertet.

Nutzen-Risiko-Bewertung

GvHD stellt eine Hauptursache für Morbidität und Mortalität nach allogener HSZT dar. Etwa 10–40 % der Patienten, die sich einer HSZT unterziehen, entwickeln eine signifikante GvHD, und etwa die Hälfte dieser Patienten stirbt an dieser Krankheit oder an therapiebedingten Komplikationen [1].

Endoskopische Verfahren bei Patienten mit Verdacht auf aGI-GvHD sind gut etabliert. Bisher ist die histologische Auswertung von GI-Biopsien der Goldstandard, um eine genaue aGI-GvHD-Diagnose zu stellen. Die Endoskopie des oberen Gastrointestinaltrakts ist komfortabler als die endoskopische Beurteilung des unteren Gastrointestinaltrakts, da keine Darmvorbereitung erforderlich ist. Daher ist es die primäre Technik zur Beurteilung von Post-HSZT-Patienten in unserer Abteilung. Gestützt durch neuere Ergebnisse der Studieninstitution [19] werden diese oberen GI-Endoskopien routinemäßig als Enteroskopien anstelle von Gastroskopien durchgeführt, um den Dünndarm in die Diagnostik einzubeziehen. Die Sicherheit der Enteroskopie wurde nicht systematisch untersucht, aber die berichteten Erfahrungen sind umfangreich und Komplikationen waren selten [24].

Die konfokale Laser-Endomikroskopie ist eine sichere neue Technik, die bereits in klinischen Studien untersucht wurde [25, 26]. Seine Sicherheit wird durch die Verwendung von Laserlicht geringer Intensität gewährleistet, das im schlimmsten Fall ein lokales Ausbleichen von Fluorescein-haltigen Zellen verursachen kann, was harmlos, reversibel ist und unter experimentellen Bedingungen sogar als diagnostisches Zeichen verwendet wird [20].

Ethische Implikationen

Dieses Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Universität Wien genehmigt.

Alle Verfahren im Rahmen dieser Studie werden in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki sowie den Richtlinien für Gute Wissenschaftliche Praxis (GSP) der Medizinischen Universität Wien durchgeführt.

Erwartete Auswirkungen und Ausblick

Wenn die Forscher aGI-GvHD-spezifische Marker finden, die für eine „biopsiefreie“ In-vivo-Diagnose der aGI-GvHD verwendet werden können, könnte dies zu einer weiteren Reduzierung invasiver Eingriffe für Patienten nach HSZT führen. Dies hätte große klinische Auswirkungen, da die Biopsiebeurteilung oft durch den schlechten Gerinnungsstatus dieser Patientengruppe eingeschränkt ist.

Für den Fall, dass sie spezifische Marker einer aGI-GvHD nicht eindeutig bestimmen können, sollte CLE zumindest die Anzahl der für die Diagnose erforderlichen konventionellen Biopsien reduzieren, indem sie unter CLE-Anleitung durchgeführt werden.

Trotz der erwarteten Reduzierung invasiver Eingriffe könnte die aGI-GvHD-Diagnose in vivo zur sofortigen Einleitung einer immunsuppressiven Behandlung führen, um das Fortschreiten und die Ausbreitung der Krankheit zu reduzieren.

Falls die Studienziele durch die Ergebnisse dieser Pilotstudie unterstützt werden, wird eine randomisierte kontrollierte Studie durchgeführt, in der die In-vivo-Diagnose mit der konventionellen histologischen Beurteilung in Bezug auf Krankenhausaufenthalt und Überleben verglichen wird.