Endomikroskopi och graft-versus-host-sjukdom

Graft-versus-host-sjukdom (GvHD) representerar en viktig orsak till sjuklighet och mortalitet hos patienter som genomgått hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT) [1]. I mag-tarmkanalen som ett av huvudmålorganen för GvHD kan diagnosen vara svår på grund av många liknande presenterande differentialdiagnoser, mest anmärkningsvärda, infektioner av cytomegalovirus [2]. Experter är oense om det bästa diagnostiska tillvägagångssättet för patienter som misstänks för akut gastrointestinal GvHD (aGI-GvHD). Det har gjorts många studier som stöder endoskopisk utvärdering av antingen den nedre [3, 4, 5], den övre [6, 7] eller båda delarna av mag-tarmkanalen [8, 9]. I båda fallen fungerar den histologiska utvärderingen av biopsiprover som standardverktyg för att fastställa den slutliga diagnosen [10].

Med tanke på det ganska dåliga allmäntillståndet hos patienter efter HSCT som en begränsande faktor för endoskopisk och histologisk utvärdering, har några nya tillvägagångssätt införts i den diagnostiska manualen för aGI-GvHD för att minska mängden invasiva undersökningar. Konventionella avbildningstekniker som magnetisk resonanstomografi [11], datortomografi [12] och högupplöst ultraljud med Doppler Imaging [13] rapporterade förtjockning av tarmväggen hos GvHD-patienter. Men eftersom sådana fynd endast är ospecifika tecken på gastrointestinal patologi, kan konventionella avbildningstekniker inte ersätta endoskopi med biopsier [14]. Detsamma gäller för videokapselendoskopi som verkligen visade sig ha ett högt negativt prediktivt värde för detektion av aGI-GvHD, men delar den viktiga bristen med saknade biopsiprover för histologisk utvärdering [15, 16, 17].

Åtminstone flyttade denna metod fokus av intresse till tunntarmen. Biopsier som härrör från denna tidigare försummade GI-del hade visat en hög känslighet för GvHD-relaterade förändringar i tidigare studier [18]. Eftersom liknande resultat sågs på studieplatsen, jämförde utredarna prospektivt enteroskopi med biopsier med den nuvarande guldstandarden i den diagnostiska aGI-GvHD-hanteringen, koloskopi med biopsier. I samband med denna undersökning visade tjocktarmen mycket starkare tillgivenhet av aGI-GvHD än alla andra platser, även om det inte fanns några par undersökningar, där koloskopi avslöjade aGI-GvHD utan närvaro av sådana fynd vid enteroskopi. Tvärtom avslöjade enteroskopi till och med GvHD-relaterade patologier i ett fall där respektive koloskopi förblev oansenlig. Följaktligen postulerade de att enteroskopiska fynd kan ersätta behovet av koloskopi [19], varför patienter efter HSCT kunde förbli utan stressande tarmförberedelser, ofta begränsade av deras ganska dåliga allmäntillstånd.

En av de senaste utvecklingarna inom endoskopisk behandling av mag-tarmkanalen är det så kallade konfokala laserendomikroskopet (CLE). Konfokalmikroskopi utvecklades av Marvin Minsky i slutet av 1950-talet. Dess princip är mikroskopisk skanning av brännpunkter under ytan av ett föremål. I jämförelse med konventionell ljusmikroskopi använder den ett speciellt filtersystem för att undvika bildöverlappning av omgivande vävnad. I detalj fokuseras en ljuskälla (normalt en laser) av ett mikroskopobjektiv till en diffraktionsbegränsad punkt på eller inuti objektet. Ljus som sprids, eller fluorescensexciteras (uppnås genom fluoresceinfärgning, till exempel) och emitteras, vid fokus i provet kommer delvis att återvända tillbaka genom optiken längs vägen från vilken det kom. En stråldelare placerad i banan reflekterar returljuset mot en detektor. Optiken kommer att fokusera ljuset från brännpunkten i provet till dess konjugerade fokus nära detektorn (därav tekniken kallas "konfokal"). Här används ett spatialfilter ("pinhole") för att släcka allt ljus som härrör från områden utanför brännpunkten. Ljusreflektioner från själva brännpunkten kommer att skickas vidare till detektorn som är ansluten till ett datorsystem som digitaliserar den optiska signalen och skapar den histologiska bilden in vivo [20].

Med fokus på dess kliniska inverkan är konfokalmikroskopi den första tekniken för att möjliggöra in vivo utvärdering av vävnadsstrukturer under deras yta. På grund av många genombrott inom miniatyrisering (främst på 1990-talet) kunde denna teknik användas för intraluminal användning inom gastroenterologi, integrerad i ett annars standardendoskop. Det möjliggör histologisk visualisering in vivo av de övre 250 mikrometerna av alla väggar i mag-tarmkanalen, förutom den normala funktionen av vitljusendoskopi (som tillhandahålls av två separata skärmar ovanpå arbetsstationen) [20].

Den första kliniska användningen av CLE i en prospektiv pilotstudie med 35 patienter efter HSCT rapporterades av Bojarski et al. År 2009. CLE i tjocktarmsslemhinnan kunde förutsäga den positiva diagnosen aGI-GvHD hos 14 av 19 patienter, senare bekräftad genom histologisk utvärdering. Fynden in vivo av aGI-GvHD, varierande från enstaka kryptapoptos till fullständig kryptförlust, var tydligt särskiljbara från patologier av annat ursprung som infektiös kolit eller ulcerös kolit, båda används som jämförande kontroll [21].

Studiemål

I denna kliniska undersökning avser utredarna att fortsätta det diagnostiska tillvägagångssättet för akut gastrointestinal graft-versus-host-sjukdom (aGI-GvHD). Baserat på de senaste resultaten vid studieinstitutionen (förklarade ovan, [19]) som visade en anmärkningsvärd diagnostisk avkastning för aGI-GvHD-associerade patologier i tunntarmen, avser forskarna att utvärdera konfokal laserendomikroskopi (CLE) av tunntarmen som primär diagnostisk procedur hos patienter med misstänkt aGI-GvHD efter hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT).

• Utredarna syftar till att undersöka om tidig diagnos av aGI-GvHD i duodenum och jejunum kan uppnås genom att utvärdera endomikroskopiska egenskaper.
• I jämförelse med konventionella biopsier från de nämnda GI-delarna som guldstandard vill utredarna testa om de markörer som beskrivs av Bojarski et al. för tjocktarmen gäller även för tunntarmen.
• Inklusive endomikroskopiska resultat av patienter med celiaki, enterala infektioner, inflammatorisk tarmsjukdom och friska försökspersoner som kontroller syftar utredarna till att etablera aGI-GvHD-specifika markörer som kan användas för en "biopsifri" in vivo-diagnos av aGI-GvHD.

Studera design

Prospektiv klinisk pilotstudie utan randomisering eller blindning

Studera befolkning

Patienter efter hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT) som remitteras till studieplatsen för att klargöra något av följande symtom:

• anorexi
• illamående
• kräkningar
• buksmärtor
• diarre
• tarmblödning

För att utesluta eventuella biverkningar av konditioneringsterapin måste GI-symtom ha uppstått eller kvarstått 20 dagar efter respektive transplantationsdatum [22].

Exklusions kriterier:

• infektion med CMV eller HSV
• bakteriell infektion i mag-tarmkanalen
• läkemedelsrelaterade symtom
• patienter som är allergiska mot en av läkemedelskomponenterna (inklusive läkemedel som används för medveten sedering som propofol eller midazolam samt fluorescein, det fluorescerande färgämnet som används för CLE)
• vägran att delta i studien
• patientens ålder under 18 år.

Metoder

Denna undersökning kommer att utföras vid det medicinska universitetet i Wien, Institutionen för internmedicin III, avdelningen för gastroenterologi och hepatologi. Patientrekrytering kommer att ske i nära samarbete med Institutionen för internmedicin I, avdelningen för onkologi, enheten för benmärgstransplantation.

Eftersom denna studie har planerats som ett pilotförsök fokuserar den huvudsakligen på de kvalitativa endomikroskopiska egenskaperna hos tunntarmen hos GvHD-patienter för att ge referenspatologier för korrekt diagnos i framtiden. Ändå kommer en kvantitativ analys att utföras genom att jämföra CLE-härledda diagnoser med histologiska resultat för att beräkna sensitivitet och specificitet för CLE-baserad aGI-GvHD-diagnos i tunntarmen. Med tanke på det nuvarande diagnostiska utbytet på 62 % för detektion av aGI-GvHD hos symtomatiska post-HSCT-patienter med konventionell histologi [19], uppskattade utredarna att inkludera 40 patienter med misstänkt aGI-GvHD för att upptäcka ett meningsfullt urval av patienter påverkas av aGI-GvHD för kvalitativ och kvantitativ analys. Som jämförelse inkluderade Bojarski et al 35 patienter av vilka 19 slutligen visade sig lida av aGI-GvHD genom konventionell histologi. De kunde sedan beräkna en sensitivitet på 74% och specificitet på 100% för förutsägelsen av den histologiska diagnosen av CLE [21]. På basis av den nuvarande frekvensen av post-HSCT-patienter vid studieplatsen uppskattar forskarna att inkludera den avsedda mängden av 40 patienter inom en tidsperiod av 2 år.

Alla patienter som uppfyller de angivna inklusionskriterierna kommer att få patientinformationsformuläret för denna studie tillsammans med det vanliga informerade samtyckesformuläret för respektive endoskopisk undersökning de ska genomgå. Patientinformation kommer att göras minst 24 timmar före insatsen, som praktiseras på vår enhet. Om patienten går med på att delta i studien kommer han/hon att förberedas för endoskopi genom administrering av intravenös propofol och/eller midazolam som rutinmässigt används för medveten sedering under endoskopiska ingrepp på vår avdelning. Dessutom kommer 5-10 ml av en 10 % lösning av fluoresceinnatrium att administreras intravenöst för att förbättra vävnadsfluorescensen under endomikroskopi. Eftersom det hittills inte finns något specifikt CLE-enteroskop kommer vi att använda CLE-koloskopet (Pentax EC-3870 CIFK med ISC-1000 konfokal endomikroskopiprocessor - Pentax, Tokyo, Japan och Optiscan Pty Ltd, Notting Hill, Victoria, Australien) att nå tunntarmen, jämförbart med ett enteroskopiskt ingrepp (oral access).

Alla läkemedel kommer att administreras av medicinska specialister, underläkare eller legitimerade sjuksköterskor, som rutinmässigt praktiseras på vår institution.

CLE-bildtagning kommer att börja på den djupaste punkt som kan nås i jejunum. Vid tillbakadragande av skopet kommer CLE-bilder att tas var 10:e centimeter i tunntarmen, sedan från antrum och magkropp och från matstrupen. Dessutom kommer CLE att appliceras för områden med olika utseende, misstänkta för patologiskt ursprung. Varhelst CLE-bilder tas, kommer en konventionell biopsi att tas från samma lokalisering.

CLE-bilder kommer att tas och lagras rutinmässigt med vårt standarddatahanteringssystem. De kommer att utvärderas omedelbart efter det endoskopiska ingreppet tillsammans med en certifierad GI-patolog, som kommer att fastställa en första diagnos.

Konventionella biopsier kommer att färgas med Haematoxylin & Eosin, såväl som PAS-färgning. Hybridisering på plats för CMV och HSV kommer att utföras för att utesluta virusinfektion. Klassificering av GvHD kommer att göras enligt McDonald och Sale i 4 grader, lämpligt modifierade för tunntarmen [23]:

• Grad I: individuell cellnekros
• Grad II: kryptabscess
• Grad III: hoppa av en eller flera hela krypter i en biopsi
• Grad IV: total denudation av epitel

Endomikroskopiska kontroller (patienter med celiaki, enterala infektioner, inflammatorisk tarmsjukdom och friska försökspersoner) kommer att samlas in från nuvarande data om endomikroskopiska ingrepp som redan utförts inom rutinundersökningar.

I slutet av studien kommer alla CLE-bilder och histologiska skärsår att utvärderas separat av två blinda certifierade patologer. Vid disharmoniska diagnoser kommer de att analysera respektive fall tillsammans för att nå en överenskommelse om den slutliga diagnosen. Alla fall där den initiala och den slutliga diagnosen avviker från varandra kommer att omvärderas tillsammans av alla inblandade specialister.

Risk/nytta bedömning

GvHD representerar en viktig orsak till sjuklighet och mortalitet efter allogen HSCT. Ungefär 10-40 % av patienterna som genomgår HSCT utvecklar signifikant GvHD, och ungefär hälften av dessa patienter dör av denna sjukdom eller av terapi resulterande komplikationer [1].

Endoskopiska procedurer hos patienter med misstänkt aGI-GvHD är väl etablerade. Hittills är den histologiska utvärderingen av GI-härledda biopsier guldstandardverktyget för att ställa en exakt aGI-GvHD-diagnos. Endoskopi av övre mag-tarmkanalen är bekvämare än endoskopisk bedömning av nedre mag-tarmkanalen eftersom det inte finns något behov av tarmförberedelse. Därför är det den primära tekniken för att bedöma patienter efter HSCT på vår avdelning. Med stöd av de senaste resultaten vid studieinstitutionen [19] utförs dessa övre GI-endoskopier rutinmässigt som enteroskopier istället för gastroskopier för att inkludera tunntarmen i den diagnostiska utvärderingen. Säkerheten vid enteroskopi har inte studerats systematiskt men den rapporterade erfarenheten är betydande och komplikationer har varit sällsynta [24].

Konfokal laserendomikroskopi är en säker ny teknik som redan har studerats i kliniska prövningar [25, 26]. Dess säkerhet garanteras genom användning av lågintensivt laserljus som i värsta fall kan orsaka lokal blekning av fluoresceininnehållande celler, vilket är ofarligt, reversibelt och till och med används som diagnostiskt tecken i experimentella förhållanden [20].

Etiska implikationer

Detta studieprotokoll godkändes av etikkommissionen vid Medical University of Vienna.

Alla procedurer inom ramen för denna studie kommer att utföras i enlighet med Helsingforsdeklarationen samt riktlinjerna för god vetenskaplig praxis (GSP) från Medical University of Vienna.

Förväntad effekt och Outlook

Om utredarna hittar aGI-GvHD-specifika markörer som kan användas för en "biopsifri" in vivo-diagnos av aGI-GvHD kan detta leda till ytterligare en minskning av invasiva procedurer för patienter efter HSCT. Detta skulle ha en stor klinisk effekt, eftersom biopsibedömning ofta begränsas av den dåliga koagulationsstatusen hos denna patientgrupp.

Om de inte tydligt kan fastställa specifika markörer för aGI-GvHD, bör CLE åtminstone minska mängden konventionella biopsier som behövs för diagnos genom att ta dem under CLE-vägledning.

Trots den förväntade minskningen av invasiva procedurer kan aGI-GvHD-diagnos in vivo leda till omedelbar initiering av immunsuppressiv behandling för att minska sjukdomens progression och platsspridning.

Om studiemålen kommer att stödjas av resultaten från denna pilotstudie, kommer en randomiserad kontrollerad studie att jämföra in vivo-diagnostik med konventionell histologisk bedömning i frågor om sjukhusvistelse och överlevnad.