Mitokondriaalinen nt3243 A>G -mutaatio Taiwanissa

Potilaat ja kliiniset ominaisuudet. Tutkimus suoritetaan Taiwanin kansallisessa yliopistosairaalassa, korkea-asteen lääketieteellisessä keskuksessa Taipeissa. Taiwanin kansallisen yliopistosairaalan lääketieteellisen genetiikan osasto vastaanottaa lähetteen ja suorittaa geneettisiä testejä sairaaloissa ympäri Taiwania. Tarkistamme lääketieteellisen kaavion kaikista potilaista, joilla on dokumentoitu mitokondrion DNA nt3243 -pistemutaatio. Demografiset tiedot, ikä oireiden alkaessa, kliiniset piirteet (mukaan lukien aivohalvaus, kohtauksen kaltaiset jaksot, maitopitoinen määrä, diabetes mellitus, kuulon heikkeneminen, myopatia, EKG-poikkeavuus, krooninen etenevä ulkoinen oftalmoplegia), asiaankuuluva sukuhistoria, hoito ja lopputulos. tallennettu. Täysi MELAS-fenotyyppi määriteltiin fokaalisen keskushermoston tapahtumien, joko kohtausten, aivohalvausten tai molempien, esiintymiseksi.

Geneettinen analyysi. Genominen DNA uutettiin perifeerisen veren leukosyyteistä käyttämällä Puregene DNA -puhdistuspakkausta (Gentra Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). Polymeraasiketjureaktio (PCR) mitokondriaalisen DNA:n nt3243-pistemutaatiolle suoritettiin vasemmalla alukkeella 5'-cggagtaatccaggtcggtt-3' ja oikealla alukkeella 5'-ggaattgaacctctgactgt-3'. Mitokondrio-DNA:n nt3243 A>G-mutaatio havaittiin Hae III -restriktioentsyymidigestion jälkeen.

Mitokondrioiden nt3243A>G-mutaation heteroplasmia havaittiin reaaliaikaisella monistusresistenttien mutaatiojärjestelmän kvantitatiivisella PCR-määrityksellä (ARMS-qPCR), kuten aiemmin on raportoitu [19]. Lyhyesti sanottuna villityypin ja mutanttikohdealukkeet, kukin 500 nM, lisättiin 10 ml:n PCR-reaktioon, joka sisälsi 1X KAPA SYBR® FAST ABI Prism® qPCR Master Mixiä (KAPABIOSYSTEMS, luettelonro KK4603) ja 4 ng genomista. DNA. Reaaliaikaiset PCR-olosuhteet olivat 2 minuuttia 50 °C:ssa, 20 sekuntia 95 °C:ssa, mitä seurasi 40 sykliä 15 sekunnin denaturaatiossa 95 °C:ssa ja 30 sekunnin pariutumis/pidennys 62 °C:ssa. Tiedot PCR-tuotteiden risti- ja fluoresenssisignaalien intensiteetistä tallennettiin ja analysoitiin ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR Systemillä (Applied Biosystems) ja StepOne-ohjelmistolla v2.1 (Applied Biosystems). Lineaarisen eksponentiaalisen vaiheen kynnyssykliä (CT-arvo) käytettiin standardikäyrän muodostamiseen ja DNA-templaatin alkuperäisen kopiomäärän mittaamiseen. Mutantti-mtDNA:n prosenttiosuus laskettiin käyttämällä seuraavaa kaavaa: Heteroplasma % = 1/(1+ 1/2△CT).

Tilastollinen analyysi. Tilastolliseen analyysiin käytettiin SPSS 17.0:aa (SPSS, Chicago, IL, USA). Tulokset annettiin mediaanina ja vaihteluvälinä tai keskiarvona ± 1 SD, kun se oli tarkoituksenmukaista. Parittomia ryhmiä vertailtiin Studentin t-testillä. Fisherin tarkkaa testiä käytettiin kahden kategorisen muuttujan välisten assosiaatioiden määrittämiseen. Cox-regressiomallia käytettiin mahdollisten prognostisten tekijöiden analysointiin. Ryhmien välisiä eroja tulosten välillä verrattiin Kaplan-Meier-estimaatin ja log-rank-testin avulla. Pearsonin korrelaatiota käytettiin korreloimaan heteroplasmia diagnoosin ikään. P-arvoa < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevänä.