Mitokondriel nt3243 A>G mutation i Taiwan

Patienter og kliniske træk. Undersøgelsen vil blive udført på National Taiwan University hospital, et tertiært medicinsk center i Taipei. Den medicinske genetikafdeling på National Taiwan University Hospital modtager henvisning og udfører genetisk testning for hospitaler rundt om i Taiwan. Vi vil gennemgå det medicinske skema over alle patienter med dokumenteret mitokondriel DNA nt3243 punktmutation. Demografiske data, alder ved symptomernes begyndelse, kliniske træk (herunder slagtilfælde, anfaldslignende episode, mælkesyreniveau, diabetes mellitus, hørenedsættelse, myopati, elektrokardiogram abnormitet, kronisk progressiv ekstern oftalmoplegi), relevant familiehistorie, behandling og udfald vil være optaget. Fuld MELAS-fænotype blev defineret som tilstedeværelsen af ​​fokale hændelser i centralnervesystemet, enten anfald, slagtilfælde eller begge dele.

Genetisk analyse. Genomisk DNA blev ekstraheret fra perifere blodleukocytter under anvendelse af Puregene DNA-oprensningskittet (Gentra Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). Polymerasekædereaktion (PCR) for mitokondriel DNA nt3243 punktmutation blev udført af venstre primer 5'-cggagtaatccaggtcggtt-3' og højre primer 5'-ggaattgaacctctgactgt-3'. Tilstedeværelse af mitokondriel DNA nt3243 A>G mutation blev påvist efter Hae III restriktionsenzymfordøjelse.

Heteroplasmi af mitokondriel nt3243A>G mutation blev detekteret ved real-time amplifikation refraktær mutation system kvantitativ PCR (ARMS-qPCR) assay som tidligere rapporteret [19]. Kort fortalt blev vildtype- og mutant-target-primere, hver 500 nM, tilsat til en 10 ml PCR-reaktion indeholdende 1X KAPA SYBR® FAST ABI Prism® qPCR Master Mix (KAPABIOSYSTEMS, Kat. nr. KK4603) og 4 ng genomisk DNA. Real-time PCR-betingelser var 2 minutter ved 50°C, 20 sekunder ved 95°C, efterfulgt af 40 cyklusser af 15 sekunders denaturering ved 95°C og 30 sekunders annealing/forlængelse ved 62°C. Data for krydspunkt og koncentration fluorescerende signalintensitet af PCR-produkter blev registreret og analyseret af ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems) og StepOne software v2.1 (Applied Biosystems). Tærskelcyklussen (CT-værdi) i den lineære eksponentielle fase blev brugt til at konstruere standardkurven og måle det oprindelige kopiantal af DNA-skabelonen. Procentdelen af ​​mutant mtDNA blev beregnet ved anvendelse af formel som nedenfor: Heteroplasmy %= 1/(1+ 1/2△CT).

Statistisk analyse. SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) blev brugt til statistisk analyse. Resultaterne blev givet som median og interval, eller middelværdi ± 1 SD, når det var relevant. Elevens t-test blev brugt til at sammenligne uparrede grupper. Fishers eksakte test blev brugt til at bestemme sammenhænge mellem to kategoriske variable. Cox-regressionsmodel blev brugt til at analysere mulige prognostiske faktorer. Inter-gruppe forskelle ved udfald blev sammenlignet med Kaplan-Meier estimat og log-rank test. Pearsons korrelation blev brugt til at korrelere heteroplasmi til diagnosealderen. En p-værdi < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.