Mitochondriální mutace nt3243 A>G na Tchaj-wanu

Pacienti a klinické příznaky. Studie bude provedena v National Taiwan University Hospital, terciárním lékařském centru v Taipei. Oddělení lékařské genetiky v National Taiwan University Hospital dostává doporučení a provádí genetické testy pro nemocnice po celém Tchaj-wanu. Zkontrolujeme lékařskou tabulku všech pacientů s dokumentovanou bodovou mutací mitochondriální DNA nt3243. Budou uvedeny demografické údaje, věk při nástupu příznaků, klinické rysy (včetně mrtvice, epizody podobné záchvatům, hladina laktózy, diabetes mellitus, poškození sluchu, myopatie, abnormalita elektrokardiogramu, chronická progresivní externí oftalmoplegie), příslušná rodinná anamnéza, léčba a výsledek zaznamenané. Úplný fenotyp MELAS byl definován jako přítomnost fokálních příhod centrálního nervového systému, buď záchvaty, mrtvice, nebo obojí.

Genetická analýza. Genomová DNA byla extrahována z leukocytů periferní krve pomocí purifikační sady Puregene DNA (Gentra Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). Polymerázová řetězová reakce (PCR) pro bodovou mutaci mitochondriální DNA nt3243 byla provedena levým primerem 5'-cggagtaatccaggtcggtt-3' a pravým primerem 5'-ggaattgaacctctgactgt-3'. Po štěpení restrikčním enzymem Hae III byla detekována přítomnost mutochondriální DNA nt3243 A>G.

Heteroplazmie mitochondriální mutace nt3243A>G byla detekována pomocí kvantitativního testu PCR refrakterních mutací v reálném čase (ARMS-qPCR), jak bylo popsáno dříve [19]. Stručně řečeno, primery divokého typu a mutantní cílové primery, každý 500 nM, byly přidány do 10ml PCR reakce obsahující 1X KAPA SYBR® FAST ABI Prism® qPCR Master Mix (KAPABIOSYSTEMS, kat. č. KK4603) a 4 ng genomického DNA. Podmínky PCR v reálném čase byly 2 minuty při 50 °C, 20 sekund při 95 °C, následovalo 40 cyklů 15 sekund denaturace při 95 °C a 30 sekund nasedání/extenze při 62 °C. Údaje o křížovém bodu a intenzitě koncentračního fluorescenčního signálu produktů PCR byly zaznamenány a analyzovány pomocí systému ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems) a softwaru StepOne v2.1 (Applied Biosystems). Prahový cyklus (hodnota CT) v lineární exponenciální fázi byl použit pro konstrukci standardní křivky a pro měření původního počtu kopií templátu DNA. Procento mutantní mtDNA bylo vypočteno pomocí vzorce, jak je uvedeno níže: Heteroplasmy %= 1/(1+ 1/2△CT).

Statistická analýza. Pro statistickou analýzu byl použit SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Výsledky byly uvedeny jako medián a rozmezí nebo průměr ± 1 SD, pokud to bylo vhodné. K porovnání nepárových skupin byl použit Studentův t-test. Ke stanovení asociací mezi dvěma kategoriálními proměnnými byl použit Fisherův exaktní test. K analýze možných prognostických faktorů byl použit Coxův regresní model. Rozdíly mezi skupinami ve výsledku byly porovnány Kaplan-Meierovým odhadem a log-rank testem. Ke korelaci heteroplazmy s věkem diagnózy byla použita Pearsonova korelace. Hodnota p < 0,05 byla považována za statisticky významnou.