Mutation mitochondriale nt3243 A>G à Taïwan

Patients et caractéristiques cliniques. L'étude sera réalisée à l'hôpital de l'Université nationale de Taiwan, un centre médical tertiaire à Taipei. Le département de génétique médicale de l'hôpital universitaire national de Taiwan reçoit des références et effectue des tests génétiques pour les hôpitaux de tout Taiwan. Nous examinerons le dossier médical de tous les patients présentant une mutation ponctuelle documentée de l'ADN mitochondrial nt3243. Les données démographiques, l'âge au début des symptômes, les caractéristiques cliniques (y compris les accidents vasculaires cérébraux, les épisodes convulsifs, le niveau lactique, le diabète sucré, la déficience auditive, la myopathie, les anomalies de l'électrocardiogramme, l'ophtalmoplégie externe progressive chronique), les antécédents familiaux pertinents, le traitement et les résultats seront enregistré. Le phénotype MELAS complet a été défini comme la présence d'événements focaux du système nerveux central, soit des convulsions, des accidents vasculaires cérébraux ou les deux.

Analyse génétique. L'ADN génomique a été extrait des leucocytes du sang périphérique à l'aide du kit de purification d'ADN Puregene (Gentra Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). La réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour la mutation ponctuelle de l'ADN mitochondrial nt3243 a été réalisée par l'amorce gauche 5'-cggagtaatccaggtcggtt-3' et l'amorce droite 5'-ggaattgaacctctgactgt-3'. La présence de la mutation nt3243 A>G de l'ADN mitochondrial a été détectée après digestion par l'enzyme de restriction Hae III.

L'hétéroplasmie de la mutation mitochondriale nt3243A> G a été détectée par un test de PCR quantitative du système de mutation réfractaire à amplification en temps réel (ARMS-qPCR) comme indiqué précédemment [19]. En bref, des amorces de type sauvage et de cible mutante, chacune de 500 nM, ont été ajoutées dans une réaction de PCR de 10 ml contenant 1X KAPA SYBR® FAST ABI Prism® qPCR Master Mix (KAPABIOSYSTEMS, Cat No. KK4603) et 4 ng de génomique ADN. Les conditions de PCR en temps réel étaient de 2 min à 50°C, 20 secondes à 95°C, suivies de 40 cycles de 15 secondes de dénaturation à 95°C et 30 secondes d'hybridation/extension à 62°C. Les données du point de croisement et de l'intensité du signal fluorescent de concentration des produits de PCR ont été enregistrées et analysées par le système de PCR en temps réel ABI StepOnePlusTM (Applied Biosystems) et le logiciel StepOne v2.1 (Applied Biosystems). Le cycle de seuil (valeur CT) dans la phase exponentielle linéaire a été utilisé pour construire la courbe standard et pour mesurer le nombre de copies d'origine de la matrice d'ADN. Le pourcentage d'ADNmt mutant a été calculé à l'aide de la formule ci-dessous : Hétéroplasmie % = 1/(1+ 1/2△CT).

Analyses statistiques. SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) a été utilisé pour l'analyse statistique. Les résultats ont été donnés sous forme de médiane et d'intervalle, ou de moyenne ± 1 SD, le cas échéant. Le test t de Student a été utilisé pour comparer des groupes non appariés. Le test exact de Fisher a été utilisé pour déterminer les associations entre deux variables catégorielles. Le modèle de régression de Cox a été utilisé pour analyser les facteurs pronostiques possibles. Les différences intergroupes au résultat ont été comparées par l'estimation de Kaplan-Meier et le test du log-rank. La corrélation de Pearson a été utilisée pour corréler l'hétéroplasmie à l'âge du diagnostic. Une valeur p < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.