Mitochondrialna mutacja nt3243 A> G na Tajwanie

Pacjenci i cechy kliniczne. Badanie zostanie przeprowadzone w szpitalu National Taiwan University, centrum medycznym trzeciego stopnia w Tajpej. Dział Genetyki Medycznej Narodowego Szpitala Uniwersyteckiego na Tajwanie otrzymuje skierowania i przeprowadza badania genetyczne dla szpitali na całym Tajwanie. Dokonamy przeglądu karty medycznej wszystkich pacjentów z udokumentowaną mutacją punktową mitochondrialnego DNA nt3243. Dane demograficzne, wiek wystąpienia objawów, objawy kliniczne (w tym udar, epizod podobny do napadu, stężenie kwasu mlekowego, cukrzyca, upośledzenie słuchu, miopatia, nieprawidłowości w elektrokardiogramie, przewlekła postępująca oftalmoplegia zewnętrzna), odpowiedni wywiad rodzinny, leczenie i wyniki zostaną nagrany. Pełny fenotyp MELAS zdefiniowano jako obecność ogniskowych zdarzeń w ośrodkowym układzie nerwowym, napadów padaczkowych, udarów mózgu lub obu.

Analiza genetyczna. Genomowy DNA ekstrahowano z leukocytów krwi obwodowej przy użyciu zestawu do oczyszczania DNA Puregene (Gentra Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). Reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) dla mutacji punktowej nt3243 mitochondrialnego DNA przeprowadzono z użyciem lewego startera 5'-cggagtaatccaggtcggtt-3' i prawego startera 5'-ggaattgaacctctgactgt-3'. Obecność mutacji nt3243 A>G mitochondrialnego DNA wykryto po trawieniu enzymem restrykcyjnym Hae III.

Heteroplazmę mitochondrialnej mutacji nt3243A> G wykryto za pomocą ilościowego testu PCR w systemie refrakcji mutacji z amplifikacją w czasie rzeczywistym (ARMS-qPCR), jak opisano wcześniej [19]. W skrócie, startery typu dzikiego i zmutowane startery, każdy po 500 nM, dodano do 10 ml reakcji PCR zawierającej 1X KAPA SYBR® FAST ABI Prism® qPCR Master Mix (KAPABIOSYSTEMS, nr kat. KK4603) i 4 ng DNA. Warunki PCR w czasie rzeczywistym obejmowały 2 minuty w 50°C, 20 sekund w 95°C, a następnie 40 cykli po 15 sekund denaturacji w 95°C i 30 sekund hybrydyzacji/wydłużania w 62°C. Dane dotyczące punktu krzyżowego i intensywności sygnału fluorescencyjnego produktów PCR rejestrowano i analizowano za pomocą systemu ABI StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems) i oprogramowania StepOne v2.1 (Applied Biosystems). Cykl progowy (wartość CT) w liniowej fazie wykładniczej wykorzystano do skonstruowania krzywej wzorcowej i do zmierzenia oryginalnej liczby kopii matrycy DNA. Procent zmutowanego mtDNA obliczono stosując poniższy wzór: % heteroplazmy = 1/(1+ 1/2△CT).

Analiza statystyczna. Do analizy statystycznej wykorzystano SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Wyniki podano jako medianę i zakres lub średnią ± 1 SD, jeśli było to właściwe. Do porównania grup niesparowanych zastosowano test t-Studenta. Dokładny test Fishera wykorzystano do określenia powiązań między dwiema zmiennymi kategorycznymi. Do analizy możliwych czynników prognostycznych zastosowano model regresji Coxa. Różnice między grupami w wynikach porównano za pomocą estymacji Kaplana-Meiera i testu log-rank. Korelacja Pearsona została wykorzystana do skorelowania heteroplazmii z wiekiem rozpoznania. Wartość p < 0,05 uznano za istotną statystycznie.