Mutazione mitocondriale nt3243 A>G a Taiwan

Pazienti e caratteristiche cliniche. Lo studio sarà condotto presso l'ospedale della National Taiwan University, un centro medico terziario di Taipei. Il dipartimento di genetica medica presso l'ospedale universitario nazionale di Taiwan riceve il rinvio e conduce test genetici per gli ospedali di tutta Taiwan. Esamineremo la cartella clinica di tutti i pazienti con mutazione puntiforme nt3243 del DNA mitocondriale documentata. I dati demografici, l'età all'insorgenza dei sintomi, le caratteristiche cliniche (inclusi ictus, episodio simil-convulsivo, livello lattico, diabete mellito, compromissione dell'udito, miopatia, anomalie dell'elettrocardiogramma, oftalmoplegia esterna progressiva cronica), anamnesi familiare rilevante, trattamento ed esito saranno registrato. Il fenotipo MELAS completo è stato definito come la presenza di eventi focali del sistema nervoso centrale, convulsioni, ictus o entrambi.

Analisi genetica. Il DNA genomico è stato estratto dai leucociti del sangue periferico utilizzando il kit di purificazione del DNA Puregene (Gentra Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). La reazione a catena della polimerasi (PCR) per la mutazione puntiforme del DNA mitocondriale nt3243 è stata eseguita dal primer sinistro 5'-cggagtaatccaggtcggtt-3' e dal primer destro 5'-ggaattgaacctctgactgt-3'. La presenza della mutazione A>G del DNA mitocondriale nt3243 è stata rilevata dopo la digestione dell'enzima di restrizione Hae III.

L'eteroplasmia della mutazione mitocondriale nt3243A> G è stata rilevata mediante analisi PCR quantitativa del sistema di mutazione refrattaria dell'amplificazione in tempo reale (ARMS-qPCR) come riportato in precedenza [19]. In breve, primer wild-type e target mutante, ciascuno da 500 nM, sono stati aggiunti a una reazione PCR da 10 ml contenente 1X KAPA SYBR® FAST ABI Prism® qPCR Master Mix (KAPABIOSYSTEMS, Cat No. KK4603) e 4 ng di genomic DNA. Le condizioni della PCR in tempo reale erano 2 minuti a 50°C, 20 secondi a 95°C, seguiti da 40 cicli di 15 secondi di denaturazione a 95°C e 30 secondi di ricottura/estensione a 62°C. I dati del punto di incrocio e dell'intensità del segnale fluorescente della concentrazione dei prodotti PCR sono stati registrati e analizzati dal sistema PCR in tempo reale ABI StepOnePlusTM (Applied Biosystems) e dal software StepOne v2.1 (Applied Biosystems). Il ciclo di soglia (valore CT) all'interno della fase esponenziale lineare è stato utilizzato per costruire la curva standard e per misurare il numero di copie originale del modello di DNA. La percentuale del mtDNA mutante è stata calcolata utilizzando la formula seguente: Eteroplasmia %= 1/(1+ 1/2△CT).

Analisi statistica. SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) è stato utilizzato per l'analisi statistica. I risultati sono stati forniti come mediana e intervallo, o media ± 1 SD, quando appropriato. Il test t di Student è stato utilizzato per confrontare gruppi non appaiati. Il test esatto di Fisher è stato utilizzato per determinare le associazioni tra due variabili categoriche. Il modello di regressione di Cox è stato utilizzato per analizzare i possibili fattori prognostici. Le differenze tra i gruppi al risultato sono state confrontate con la stima di Kaplan-Meier e il test log-rank. La correlazione di Pearson è stata utilizzata per correlare l'eteroplasmia all'età della diagnosi. Un valore p <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.