Mutación mitocondrial nt3243 A>G en Taiwán

Pacientes y características clínicas. El estudio se llevará a cabo en el hospital de la Universidad Nacional de Taiwán, un centro médico terciario en Taipei. El Departamento de Genética Médica del Hospital Universitario Nacional de Taiwán recibe referencias y realiza pruebas genéticas para hospitales de todo Taiwán. Revisaremos la historia clínica de todos los pacientes con mutación puntual nt3243 del ADN mitocondrial documentada. Se evaluarán los datos demográficos, la edad de aparición de los síntomas, las características clínicas (que incluyen accidente cerebrovascular, episodio convulsivo, nivel láctico, diabetes mellitus, discapacidad auditiva, miopatía, anomalías en el electrocardiograma, oftalmoplejía externa progresiva crónica), antecedentes familiares relevantes, tratamiento y resultado. grabado. El fenotipo completo de MELAS se definió como la presencia de eventos focales del sistema nervioso central, ya sea convulsiones, accidentes cerebrovasculares o ambos.

Análisis genético. El ADN genómico se extrajo de leucocitos de sangre periférica utilizando el kit de purificación de ADN Puregene (Gentra Systems, Minneapolis, Minnesota, EE. UU.). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la mutación puntual nt3243 del ADN mitocondrial se llevó a cabo mediante el cebador izquierdo 5'-cggagtaatccaggtcggtt-3' y el cebador derecho 5'-ggaattgaacctctgactgt-3'. Se detectó la presencia de la mutación nt3243 A>G del ADN mitocondrial después de la digestión con la enzima de restricción Hae III.

La heteroplasmia de la mutación nt3243A>G mitocondrial se detectó mediante el ensayo de PCR cuantitativa del sistema de mutación refractario de amplificación en tiempo real (ARMS-qPCR) como se informó anteriormente [19]. En resumen, se agregaron cebadores de tipo salvaje y mutantes, cada uno 500 nM, en una reacción de PCR de 10 ml que contenía 1X KAPA SYBR® FAST ABI Prism® qPCR Master Mix (KAPABIOSYSTEMS, Cat No. KK4603) y 4 ng de genómico. ADN. Las condiciones de la PCR en tiempo real fueron 2 min a 50 °C, 20 segundos a 95 °C, seguidos de 40 ciclos de 15 segundos de desnaturalización a 95 °C y 30 segundos de hibridación/extensión a 62 °C. Los datos del punto de cruce y la intensidad de la señal fluorescente de concentración de los productos de PCR se registraron y analizaron mediante el sistema de PCR en tiempo real ABI StepOnePlusTM (Applied Biosystems) y el software StepOne v2.1 (Applied Biosystems). El ciclo umbral (valor CT) dentro de la fase exponencial lineal se usó para construir la curva estándar y para medir el número de copias originales de la plantilla de ADN. El porcentaje de ADNmt mutante se calculó usando la fórmula siguiente: Heteroplasmia %= 1/(1+ 1/2△CT).

Análisis estadístico. Se utilizó SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL, EE. UU.) para el análisis estadístico. Los resultados se dieron como mediana y rango, o media ± 1 DE, cuando correspondía. Se usó la prueba t de Student para comparar grupos no apareados. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para determinar asociaciones entre dos variables categóricas. Se utilizó el modelo de regresión de Cox para analizar los posibles factores pronósticos. Las diferencias entre grupos en el resultado se compararon mediante la estimación de Kaplan-Meier y la prueba de rango logarítmico. Se utilizó la correlación de Pearson para correlacionar la heteroplasmia con la edad del diagnóstico. Un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.