Mitokondriell nt3243 A>G-mutasjon i Taiwan

Pasienter og kliniske trekk. Studien vil bli utført ved National Taiwan University Hospital, et tertiærmedisinsk senter i Taipei. Den medisinske genetikkavdelingen ved National Taiwan University Hospital mottar henvisning og utfører genetisk testing for sykehus rundt om i Taiwan. Vi vil gjennomgå det medisinske kartet over alle pasienter med dokumentert mitokondriell DNA nt3243 punktmutasjon. Demografiske data, alder ved symptomdebut, kliniske trekk (inkludert hjerneslag, anfallslignende episode, melkesyrenivå, diabetes mellitus, hørselshemming, myopati, elektrokardiogramavvik, kronisk progressiv ekstern oftalmoplegi), relevant familiehistorie, behandling og utfall vil være innspilt. Full MELAS-fenotype ble definert som tilstedeværelsen av fokale hendelser i sentralnervesystemet, enten anfall, slag eller begge deler.

Genetisk analyse. Genomisk DNA ble ekstrahert fra perifere blodleukocytter ved bruk av Puregene DNA-rensesettet (Gentra Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). Polymerasekjedereaksjon (PCR) for mitokondriell DNA nt3243 punktmutasjon ble utført av venstre primer 5'-cggagtaatccaggtcggtt-3' og høyre primer 5'-ggaattgaacctctgactgt-3'. Tilstedeværelse av mitokondriell DNA nt3243 A>G mutasjon ble påvist etter Hae III restriksjonsenzymfordøyelse.

Heteroplasmi av mitokondriell nt3243A>G mutasjon ble oppdaget ved sanntids amplifikasjons refraktær mutasjonssystem kvantitativ PCR (ARMS-qPCR) analyse som tidligere rapportert [19]. Kort fortalt ble villtype- og mutant-target-primere, hver 500 nM, tilsatt i en 10 ml PCR-reaksjon som inneholdt 1X KAPA SYBR® FAST ABI Prism® qPCR Master Mix (KAPABIOSYSTEMS, Kat. nr. KK4603) og 4 ng genomisk DNA. Sanntids PCR-betingelser var 2 minutter ved 50 °C, 20 sekunder ved 95 °C, etterfulgt av 40 sykluser med 15 sekunders denaturering ved 95 °C og 30 sekunder med annealing/forlengelse ved 62 °C. Data for krysspunkt og konsentrasjon fluorescerende signalintensitet for PCR-produkter ble registrert og analysert av ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems) og StepOne programvare v2.1 (Applied Biosystems). Terskelsyklusen (CT-verdi) innenfor den lineære eksponentielle fasen ble brukt til å konstruere standardkurven og måle det opprinnelige kopinummeret til DNA-malen. Prosentandelen av mutant mtDNA ble beregnet ved å bruke formelen som nedenfor: Heteroplasmi %= 1/(1+ 1/2△CT).

Statistisk analyse. SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) ble brukt for statistisk analyse. Resultatene ble gitt som median og område, eller gjennomsnitt ± 1 SD, når det var hensiktsmessig. Elevens t-test ble brukt til å sammenligne uparrede grupper. Fishers eksakte test ble brukt for å bestemme assosiasjoner mellom to kategoriske variabler. Cox-regresjonsmodell ble brukt for å analysere mulige prognostiske faktorer. Inter-gruppe forskjeller ved utfall ble sammenlignet med Kaplan-Meier estimat og log-rank test. Pearsons korrelasjon ble brukt for å korrelere heteroplasmi til diagnosealder. En p-verdi < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.