Mitokondriell nt3243 A>G-mutation i Taiwan

Patienter och kliniska egenskaper. Studien kommer att genomföras vid National Taiwan University Hospital, ett tertiärt medicinskt center i Taipei. Medical Genetics Department vid National Taiwan University Hospital får remiss och genomför genetiska tester för sjukhus runt om i Taiwan. Vi kommer att granska det medicinska diagrammet för alla patienter med dokumenterad mitokondriell DNA nt3243 punktmutation. Demografiska data, ålder vid symptomdebut, kliniska egenskaper (inklusive stroke, anfallsliknande episod, mjölksyranivå, diabetes mellitus, hörselnedsättning, myopati, elektrokardiogramavvikelse, kronisk progressiv extern oftalmoplegi), relevant familjehistoria, behandling och resultat kommer att vara spelade in. Full MELAS-fenotyp definierades som närvaron av fokala händelser i centrala nervsystemet, antingen anfall, stroke eller båda.

Genetisk analys. Genomiskt DNA extraherades från perifera blodleukocyter med användning av Puregene DNA-reningskit (Gentra Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). Polymeraskedjereaktion (PCR) för mitokondriell DNA nt3243 punktmutation utfördes av vänster primer 5'-cggagtaatccaggtcggtt-3' och höger primer 5'-ggaattgaacctctgactgt-3'. Närvaro av mitokondrie-DNA nt3243 A>G-mutation detekterades efter Hae III-restriktionsenzymdigestion.

Heteroplasmi av mitokondriell nt3243A>G mutation upptäcktes av realtidsförstärkning refraktär mutationssystem kvantitativ PCR (ARMS-qPCR) analys som tidigare rapporterats [19]. Kortfattat tillsattes vildtyps- och mutantmålprimrar, vardera 500 nM, till en 10 ml PCR-reaktion innehållande 1X KAPA SYBR® FAST ABI Prism® qPCR Master Mix (KAPABIOSYSTEMS, Kat. nr. KK4603) och 4 ng genomisk DNA. Realtids-PCR-förhållanden var 2 minuter vid 50°C, 20 sekunder vid 95°C, följt av 40 cykler med 15 sekunders denaturering vid 95°C och 30 sekunders hybridisering/förlängning vid 62°C. Data för korspunkt och koncentration av fluorescerande signalintensitet för PCR-produkter registrerades och analyserades med ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems) och StepOne programvara v2.1 (Applied Biosystems). Tröskelcykeln (CT-värde) inom den linjära exponentiella fasen användes för att konstruera standardkurvan och för att mäta det ursprungliga kopiantalet av DNA-mallen. Procentandelen av mutant mtDNA beräknades med användning av formeln enligt nedan: Heteroplasmy %= 1/(1+ 1/2△CT).

Statistisk analys. SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) användes för statistisk analys. Resultaten gavs som median och intervall, eller medelvärde ± 1 SD, när så var lämpligt. Elevens t-test användes för att jämföra oparade grupper. Fishers exakta test användes för att fastställa samband mellan två kategoriska variabler. Cox-regressionsmodell användes för att analysera möjliga prognostiska faktorer. Skillnader mellan grupper vid utfall jämfördes med Kaplan-Meier uppskattning och log-rank test. Pearsons korrelation användes för att korrelera heteroplasmi till diagnosens ålder. Ett p-värde < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant.