Mutação mitocondrial nt3243 A>G em Taiwan

Pacientes e características clínicas. O estudo será realizado no hospital da Universidade Nacional de Taiwan, um centro médico terciário em Taipei. O Departamento de Genética Médica do Hospital da Universidade Nacional de Taiwan recebe encaminhamento e realiza testes genéticos para hospitais em todo Taiwan. Iremos revisar o prontuário médico de todos os pacientes com mutação pontual documentada do DNA mitocondrial nt3243. Dados demográficos, idade de início dos sintomas, características clínicas (incluindo acidente vascular cerebral, episódio semelhante a convulsão, nível láctico, diabetes mellitus, deficiência auditiva, miopatia, anormalidade eletrocardiográfica, oftalmoplegia externa progressiva crônica), história familiar relevante, tratamento e desfecho serão gravado. O fenótipo MELAS completo foi definido como a presença de eventos focais do sistema nervoso central, convulsões, acidentes vasculares cerebrais ou ambos.

Análise genética. O DNA genômico foi extraído de leucócitos do sangue periférico usando o kit de purificação de DNA Puregene (Gentra Systems, Minneapolis, Minnesota, EUA). A reação em cadeia da polimerase (PCR) para mutação pontual do DNA mitocondrial nt3243 foi realizada pelo primer esquerdo 5'-cggagtaatccaggtcggtt-3' e primer direito 5'-ggaattgaacctctgactgt-3'. A presença da mutação nt3243 A>G do DNA mitocondrial foi detectada após a digestão com a enzima de restrição Hae III.

A heteroplasmia da mutação mitocondrial nt3243A>G foi detectada pelo ensaio PCR quantitativo do sistema de mutação refratária à amplificação em tempo real (ARMS-qPCR), conforme relatado anteriormente [19]. Em resumo, primers de tipo selvagem e alvo mutante, cada 500 nM, foram adicionados em uma reação de PCR de 10 ml contendo 1X KAPA SYBR® FAST ABI Prism® qPCR Master Mix (KAPABIOSYSTEMS, Cat No. KK4603) e 4 ng de genoma DNA. As condições de PCR em tempo real foram 2 min a 50°C, 20 segundos a 95°C, seguidos de 40 ciclos de 15 segundos de desnaturação a 95°C e 30 segundos de anelamento/extensão a 62°C. Os dados de ponto de cruzamento e intensidade do sinal fluorescente de concentração dos produtos de PCR foram registrados e analisados ​​pelo sistema ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR (Applied Biosystems) e software StepOne v2.1 (Applied Biosystems). O ciclo limiar (valor CT) dentro da fase exponencial linear foi usado para construir a curva padrão e para medir o número de cópias originais do molde de DNA. A porcentagem do mtDNA mutante foi calculada usando a fórmula abaixo: Heteroplasmia %= 1/(1+ 1/2△CT).

Análise estatística. SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA) foi usado para análise estatística. Os resultados foram apresentados como mediana e intervalo, ou média ± 1 DP, quando apropriado. O teste t de Student foi utilizado para comparar os grupos não pareados. O teste exato de Fisher foi usado para determinar associações entre duas variáveis ​​categóricas. O modelo de regressão de Cox foi utilizado para analisar possíveis fatores prognósticos. As diferenças intergrupos no resultado foram comparadas pela estimativa de Kaplan-Meier e teste de log-rank. A correlação de Pearson foi usada para correlacionar a heteroplasmia com a idade do diagnóstico. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.