Митохондриальная мутация nt3243 A>G на Тайване

Больные и клинические проявления. Исследование будет проводиться в больнице Национального Тайваньского университета, специализированном медицинском центре в Тайбэе. Отделение медицинской генетики в больнице Национального университета Тайваня получает направление и проводит генетическое тестирование для больниц по всему Тайваню. Мы рассмотрим медицинские карты всех пациентов с задокументированной точечной мутацией митохондриальной ДНК nt3243. Демографические данные, возраст на момент появления симптомов, клинические признаки (включая инсульт, судорожный эпизод, уровень лактата, сахарный диабет, нарушение слуха, миопатию, аномалии электрокардиограммы, хроническую прогрессирующую наружную офтальмоплегию), соответствующий семейный анамнез, лечение и исход будут записано. Полный фенотип MELAS определялся как наличие фокальных событий центральной нервной системы, таких как судороги, инсульты или и то, и другое.

Генетический анализ. Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови с использованием набора для очистки ДНК Puregene (Gentra Systems, Миннеаполис, Миннесота, США). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) на точечную мутацию митохондриальной ДНК nt3243 проводили с левым праймером 5'-cggagtaatccaggtcggtt-3' и правым праймером 5'-ggaattgaacctctgactgt-3'. Наличие мутации митохондриальной ДНК nt3243 A>G было обнаружено после расщепления рестрикционным ферментом Hae III.

Гетероплазмия митохондриальной мутации nt3243A>G была обнаружена с помощью системы количественной ПЦР с рефрактерной амплификации в реальном времени (ARMS-qPCR), как сообщалось ранее [19]. Вкратце, праймеры-мишени дикого типа и мутантные праймеры, каждый по 500 нМ, добавляли в 10-мл реакционную смесь для ПЦР, содержащую 1X KAPA SYBR® FAST ABI Prism® qPCR Master Mix (KAPABIOSYSTEMS, кат. № KK4603) и 4 нг геномного ДНК. Условия ПЦР в реальном времени: 2 минуты при 50°C, 20 секунд при 95°C, затем 40 циклов по 15 секунд денатурации при 95°C и 30 секунд отжига/удлинения при 62°C. Данные точки пересечения и интенсивности флуоресцентного сигнала концентрации продуктов ПЦР регистрировали и анализировали с помощью системы ПЦР в реальном времени ABI StepOnePlusTM (Applied Biosystems) и программного обеспечения StepOne v2.1 (Applied Biosystems). Пороговый цикл (значение CT) в линейной экспоненциальной фазе использовали для построения стандартной кривой и измерения исходного числа копий ДНК-матрицы. Процент мутантной мтДНК рассчитывали по следующей формуле: Гетероплазмия %= 1/(1+ 1/2△CT).

Статистический анализ. Для статистического анализа использовали SPSS 17.0 (SPSS, Чикаго, Иллинойс, США). Результаты были представлены как медиана и диапазон или среднее значение ± 1 стандартное отклонение, когда это уместно. Для сравнения непарных групп использовали t-критерий Стьюдента. Точный критерий Фишера использовался для определения связи между двумя категориальными переменными. Для анализа возможных прогностических факторов использовалась регрессионная модель Кокса. Межгрупповые различия в исходах сравнивали с помощью оценки Каплана-Мейера и логарифмического рангового критерия. Корреляция Пирсона использовалась для корреляции гетероплазмии с возрастом постановки диагноза. Значение p <0,05 считалось статистически значимым.