Mitochondriale nt3243 A>G-Mutation in Taiwan

Patienten und klinische Merkmale. Die Studie wird am National Taiwan University Hospital, einem tertiären medizinischen Zentrum in Taipei, durchgeführt. Die Abteilung für medizinische Genetik am National Taiwan University Hospital erhält eine Überweisung und führt Gentests für Krankenhäuser in ganz Taiwan durch. Wir werden die Krankenakte aller Patienten mit dokumentierter mitochondrialer DNA-nt3243-Punktmutation überprüfen. Demografische Daten, Alter bei Auftreten der Symptome, klinische Merkmale (einschließlich Schlaganfall, anfallsartige Episoden, Laktatspiegel, Diabetes mellitus, Hörbehinderung, Myopathie, Anomalie des Elektrokardiogramms, chronisch progressive externe Ophthalmoplegie), relevante Familienanamnese, Behandlung und Ergebnis werden sein verzeichnet. Der vollständige MELAS-Phänotyp wurde definiert als das Vorhandensein fokaler Ereignisse des Zentralnervensystems, entweder Krampfanfälle, Schlaganfälle oder beides.

Genetische Analyse. Genomische DNA wurde aus peripheren Blutleukozyten unter Verwendung des Puregene-DNA-Reinigungskits (Gentra Systems, Minneapolis, Minnesota, USA) extrahiert. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) für die mitochondriale DNA nt3243-Punktmutation wurde mit dem linken Primer 5'-cggagtaatccaggtcggtt-3' und dem rechten Primer 5'-ggaattgaacctctgactgt-3' durchgeführt. Das Vorhandensein einer mitochondrialen DNA nt3243 A>G-Mutation wurde nach dem Hae III-Restriktionsenzymverdau nachgewiesen.

Die Heteroplasmie der mitochondrialen nt3243A>G-Mutation wurde durch einen quantitativen Echtzeit-Amplifikations-Mutationssystem-Assay (ARMS-qPCR) nachgewiesen [19]. Kurz gesagt, Wildtyp- und Mutanten-Target-Primer, jeweils 500 nM, wurden in eine 10-ml-PCR-Reaktion gegeben, die 1X KAPA SYBR® FAST ABI Prism® qPCR-Master-Mix (KAPABIOSYSTEMS, Kat.-Nr. KK4603) und 4 ng Genom enthielt DNS. Echtzeit-PCR-Bedingungen waren 2 Minuten bei 50°C, 20 Sekunden bei 95°C, gefolgt von 40 Zyklen von 15 Sekunden Denaturierung bei 95°C und 30 Sekunden Annealing/Extension bei 62°C. Die Daten der Crosspoint- und Konzentrationsfluoreszenzsignalintensität von PCR-Produkten wurden aufgezeichnet und mit dem ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems) und der StepOne Software v2.1 (Applied Biosystems) analysiert. Der Schwellenzyklus (CT-Wert) innerhalb der linearen exponentiellen Phase wurde verwendet, um die Standardkurve zu erstellen und die ursprüngliche Kopienzahl der DNA-Matrize zu messen. Der Prozentsatz der mutanten mtDNA wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: Heteroplasmie % = 1/(1+ 1/2△CT).

Statistische Analyse. Für die statistische Analyse wurde SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) verwendet. Die Ergebnisse wurden gegebenenfalls als Median und Bereich oder als Mittelwert ± 1 Standardabweichung angegeben. Der Student-t-Test wurde verwendet, um ungepaarte Gruppen zu vergleichen. Fishers exakter Test wurde verwendet, um Assoziationen zwischen zwei kategorialen Variablen zu bestimmen. Das Cox-Regressionsmodell wurde verwendet, um mögliche prognostische Faktoren zu analysieren. Unterschiede zwischen den Gruppen beim Ergebnis wurden mittels Kaplan-Meier-Schätzung und Log-Rank-Test verglichen. Die Pearson-Korrelation wurde verwendet, um die Heteroplasmie mit dem Alter der Diagnose zu korrelieren. Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.