Mesenkymaaliset kantasolut säteilyn aiheuttamaa kserostomiaa varten (MESRIX)

Suunnittelu Satunnaistettu, kontrolloitu koe sokaisulla. Allokoinnin piilottamisen säilyttämiseksi kaikki osallistujat, hoitajat, tutkimustutkijat ja tulosten arvioijat veripankin henkilökuntaa lukuun ottamatta sokeutuvat interventioon. Veripankin henkilökunnalla ei sinänsä ole suoraa yhteyttä potilaisiin (jäljempänä osallistujat).

Projektisuunnitelma Tutkimukseen osallistumista varten osallistujilta otetaan tavanomainen sairaushistoria Kööpenhaminan yliopistollisen sairaalan Rigshospitaletin korva-, nenä- ja kurkkukirurgian osaston ohjeiden mukaisesti.

Kaikille osallistujille suoritetaan minihuuliimu, josta MSC:t laajennetaan ex vivo hyvän tuotantotavan (GMP) hyväksymään puhdastilatilaan (The Blood Bank, osa 2014). Kun solut saapuvat veripankkiin, osallistujat satunnaistetaan joko laajentamaan mesenkymaalisia kantasolujaan ex vivo tai pakastamaan ne mahdollista myöhempää käyttöä varten. Odotettu ex vivo -laajennusvaihe on 3-4 viikkoa. Puhdistus ja eristys perustuvat aiemmin kliiniseen käyttöön hyväksyttyyn protokollaan.

Injektioon tarvittavien MSC-solujen määrä Julkaistujen eläintutkimusten perusteella hiirille kserostomiaan annettu määrä vaihtelee 2 x 105:stä 2 x 106:een [19]. Näiden hiirten tietojen muuntamiseksi realistiseksi annokseksi ihmisillä olemme ekstrapoloineet seuraavien tietojen perusteella: Submandibulaaristen rauhasten tilavuustiheys on hyvin lähellä 1 (1,06-1,07). mg/mm3) [27]. Hiirillä tehdyissä sädehoitotutkimuksissa rauhasten keskimääräinen paino oli noin 350 mg, mikä vastaa noin 350 mm3:n tilavuutta. Siksi hiiren annos pr. rauhasen tilavuus on noin 286 000-2 860 000 solua PR. cm3 rauhanen (kun lasketaan joko 1 x 105 - 1 x 106). Submandibulaarisen rauhasen tilavuus ihmisillä sädehoidon jälkeen on 6,6-7,9 cm3 [28]. Tämä vastaa likimääräistä annosta per. potilas, jonka koko on 1,9 x 106 - 2,2 x 106 tai 1,9 x 107 - 2,2 x 107 solua per. submandibulaarinen rauhanen. Yllä olevista oletuksista ja jotta emme antaisi muutamille soluille, olemme päättäneet edetä maksimiannoksella, joka vastaa 2,8*10^6 MSC/cm^3 rauhasta, eli maksimikokonaisannos potilasta kohti on noin 4,6*10 ^7 MSC:tä. Potilaille annetun annoksen standardoimiseksi annettu määrä standardoidaan heidän submandibulaaristen rauhasten koon mukaan alla kuvatulla tavalla.

MSC:iden injektio alaleuan rauhasiin Koehenkilöt menevät ENT-osastolle, osa 2073 sairaalahoitoon. Kirurginen toimenpide suoritetaan paikallispuudutuksessa ultraääniohjauksella ja steriilillä tekniikalla. Saatuaan MSC-suspension tai plasebosuspension kirurgi tunnistaa submandibulaariset rauhaset ja ruiskuttaa suspension MSC:t. Injektoitujen MSC:iden lukumäärän laskeminen per. osallistuja perustuu seuraavaan laskelmaan: , jossa tilavuus on submandibulaarisen rauhasen tilavuus ja rauhasen tilavuus n. 7-8cm3 on normi. Siksi kullekin osallistujalle annettujen solujen määrä on noin. yhteensä. Jälkeenpäin osallistujalle annetaan side ja reseptivapaa kipulääke. MSC:t suspendoidaan isotoniseen NaCl:iin (0,9 mg/ml) ja ihmisen albumiiniin (HA) 1 % lopulliseen tilavuuteen 2 ml. Plasebo on 2 ml isotonista NaCl:a (0,9 mg/ml) ja HA 1 %.

Vastaanottajapaikan seuranta MRI tehdään 3-4 viikon ja 3-4 kuukauden kuluttua leikkauksesta. MRI:tä käytetään sylkirauhasten tilavuuden määrittämiseen ja vastaanottajan paikan valvontaan.

3-4 kuukauden kuluttua yhdestä kahdesta sylkirauhasesta otetaan satunnaisesti pieni biopsia. Toimenpide suoritetaan paikallispuudutuksessa. Histologia määritetään (näytteet sokennetaan patologille).

Kun viimeinen MRI, biopsia ja syljen toimintakoe on tehty n. 3-4 kuukautta hoidon jälkeen spesifiset tutkimukseen liittyvät testit ja toiminnot saadaan päätökseen. Myöhäisten komplikaatioiden tai myöhäisten haittatapahtumien havaitsemiseksi kaikki MSC-hoitoa saaneet tutkimuksen osallistujat kutsutaan tarkastukseen 1 ja 3 vuotta hoidon jälkeen.

MSC:n turvallisuus, eristäminen ja leviäminen Veripankilla on solukudoshyväksyntä Tanskan terveys- ja lääkeviranomaiselta (Tanskan kudoslain mukaisesti) sekä valmistajan/maahantuojan lupa koskien ihmislääkkeitä, tarvittavat fyysiset tilat, henkilöstöä ja toimintaresursseja hyvän valmistustavan (GMP) mukaisesti.

MSC-tuotteesta testataan tunnistetut pintamarkkerit (CD73, CD90, CD105) virtaussytometriaa käyttäen, ja sille tehdään yleiset laatutarkastukset ennen lopullista vapauttamista (solujen elinkelpoisuus ja mikro-organismit). MSC:n viljelyssä käytämme peruselatusainetta, jota on täydennetty terveiden verenluovuttajien ihmisen verihiutalelysaatilla aiemman eläinperäisen seerumin (fetal bovine seerum, FBS) sijaan. Tällä on seuraavat edut: 1) Ei todennäköisyyttä sekä tunnettujen että tuntemattomien eläinpatogeenien transfektiolle tai ksenoimmunisaation riskiä 2) Pieni eräkohtainen vaihtelu ja siten johdonmukaisempi kasvukyky, koska jokainen ryhmä valmistetaan noin. 50 tervettä luovuttajaa.

Kaikki MSC:n sadonkorjuu, eristäminen, laajentaminen jne. on GMP-määräysten mukaista. Veripankissa on Tanskan terveys- ja lääkeviranomaisen hyväksymät puhdastilatilat GMP-yhteensopivien solujen laajentamiseen kliiniseen käyttöön, ja kaikki tutkimukset suorittaa erityisesti koulutettu henkilöstö.

Kserostomian ja subjektiivisen hoitotuloksen arviointi Hoidon subjektiivinen vaikutus arvioidaan potilaan täyttämällä 100 mm:n visuaalisella analogisella kserostomia-asteikolla [31] ja lääkärin arvioimalla kyselylomakkeella [32], sekä ennen että jälkeen. hoitoon. Jokaiselta osallistujalta kysytään myös suun kuivumisen päivittäisistä oireista UKU:n sivuvaikutusasteikkokohdan 3.3 mukaisesti [29]. Tämä asteikko sisältää neljä pistettä, joissa 0 tarkoittaa, ettei suun kuivumista tunne, 1 tarkoittaa lievää suun kuivumisen tunnetta, 2 tarkoittaa voimakasta suun kuivumisen tunnetta ja 3 tarkoittaa kiusallista suun kuivumisen tunnetta, joka vaikeuttaa puhetta ja syömistä.

Syljen virtausnopeuden ja objektiivisen hoitotuloksen arviointi Muutokset stimuloimattoman koko syljen erittymisnopeudessa suuontelossa on luultavasti tärkein parametri kserostomian ja siihen liittyvien patologisten suun tilojen biologiselle kehittymiselle. Suuontelossa sekoittuu koko sylki, esim. suuren ja pienemmän sylkirauhasen eritteet. Tämän arvon oikea määrittäminen on ratkaisevan tärkeää hoidon tuloksen arvioimiseksi tässä projektissa. Syljen virtausnopeuden arvioimiseksi koko sylki kerätään klo 9-12 välillä. Koehenkilöt pidättäytyvät syömästä, juomasta, tupakoimasta ja suuhygieniasta 2 tuntia ennen keräystä. Istuttuaan pystysuorassa tuolissa he rentoutuvat 5 minuutin ajan ja sitten heitä ohjataan tekemään mahdollisimman vähän liikkeitä, mukaan lukien nieleminen, keräyksen aikana.

Ennen ja jälkeen hoidon stimuloimaton koko sylki kerätään sylkemismenetelmällä [33], jossa osallistujat sylkevät sylkensä keräysastiaan 15 minuutin ajan. Syljen virtausnopeus (SFR) (ml/min) määritetään säiliön painon lisäyksenä jaettuna keräysajalla minuuteissa.

Stimuloimattoman syljen keräämisen jälkeen koehenkilöitä neuvotaan pureskelemaan 1 g steriiliä parafiinivahaa. Heitä pyydetään pitämään suunsa kiinni pureskelun aikana ja välttämään nielemistä. 60 sekunnin välein heitä pyydetään sylkemään uuteen syljenkerääjään ennen uuden pureskelujakson aloittamista. Tätä toistetaan 5 minuutin ajan.

Submandibulaaristen rauhasten hoitotuloksen arvioimiseksi sylkeä kerätään myös suoraan suun pohjasta stimuloimattomassa ja stimuloidussa tilassa. Submandibulaaristen rauhasten stimuloimaton koko syljen virtaus määritetään vanupuikkomenetelmällä pumpulirullilla, jotka asetetaan bukkaalisesti jokaiselle yläleuan poskialueelle ja kielen alle suun pohjalle. Välittömästi ennen keräyksen alkua heitä pyydetään nielemään, mikäli tämä ei ole mahdollista, sylki poistetaan pipetillä. Keräys tapahtuu kahdessa peräkkäisessä 3 minuutin jaksossa ja jokaisen jakson lopussa leuka ja huulet pyyhitään lautasliinalla. Syljen virtausnopeudet määritetään painon mukaan (1 g vastaa 1 ml sylkeä) rullilla ja lautasliinoilla, jotka punnitaan ennen keräystä ja punnitaan uudelleen sen jälkeen. Virtausnopeudet lasketaan painon lisäyksenä keräyksen aikana ja ilmaistaan ​​millilitroina minuutissa. Puuvillarullien sylki uutetaan sentrifugoimalla (1500 g) ja sen koostumus analysoidaan. Tämä stimuloitu keräysprosessi suoritetaan jälkeenpäin sitrushedelmiä sisältävillä rullilla, jotta submandibulaariset rauhaset stimuloisivat maksimaalisesti. Jokaisesta näistä sylkikokoelmista sylki jaetaan eriin ja säilytetään -800 C:ssa.

Syljen kemiallinen analyysi Kokonainen sylki sisältää suuren määrän bakteereja ja epiteelisoluja sekä ienhapon nestettä. Siksi koko sylki ei normaalisti sovellu herkkien kemiallisten parametrien analysointiin. Tätä tarkoitusta varten yksittäisistä rauhasista valikoivasti kerätty sylki on paljon parempi. Tämän seurauksena suurin osa analyyseistä voidaan tehdä joko korvasylkirauhasesta ja submandibulaarisesta rauhasesta / sublingualis-syljestä. Kerätylle syljelle tehdään seuraavat analyysit: pH ja bikarbonaatti ionitasapainon arvioimalla [34], natrium, kalium, kalsium, fosfaatti, kloridi ja fluoridi [35], kokonaisproteiini ja valitut proteiinit [36] ja amylaasi [37]. . Tutkimusten tarkoituksena on arvioida, normalisoituuko sylki hoidon jälkeen, ja siten antaa arvio syljen hampaiden ja limakalvojen suojakyvystä ennen ja jälkeen hoidon.

Tiedonkeruu ja -analyysi Lähdetiedot: Kaikille tapausraporttilomakkeelle (CRF) on lähdedokumentaatio.

Tutkimusjohtaja antaa suoran pääsyn tutkimustietoihin ja tutkimusasiakirjoihin tiedeeettisen komitean, Tanskan terveys- ja lääkeviranomaisen tai vastaavien muiden maiden viranomaisten seurantaa, auditointia ja tarkastuksia varten. Tanskan tietosuojalain mukaiseen henkilötietojen käsittelyyn pyydetään lupa DPA:lta. Hakemukset lähetetään Rigshospitaletin lakisihteeristön kautta.