Mesenchymale Stammzellen für strahleninduzierte Xerostomie (MESRIX)

Design Randomisierte, kontrollierte Studie mit Verblindung. Um die Geheimhaltung der Zuordnung aufrechtzuerhalten, werden alle Teilnehmer, Betreuer, Studienprüfer und Ergebnisbewerter mit Ausnahme des Personals der Blutbank für die Intervention blind gemacht. Mitarbeiter der Blutbank haben keinen direkten Kontakt mit den Patienten (im Folgenden die Teilnehmer) als solche.

Projektplan Für die Aufnahme in die Studie wird den Teilnehmern ihre übliche Krankengeschichte gemäß den Richtlinien der Abteilung für Hals-, Nasen- und Ohrenchirurgie des Rigshospitalet der Universität Kopenhagen entnommen.

Alle Teilnehmer werden einer Mini-Lippenabsaugung unterzogen, aus der MSCs ex vivo in einer GMP-zugelassenen Reinraumeinrichtung (The Blood Bank, Abschnitt 2014) expandiert werden. Wenn die Zellen in der Blutbank ankommen, werden die Teilnehmer randomisiert, um entweder ihre mesenchymalen Stammzellen ex vivo zu expandieren oder sie für eine mögliche spätere Verwendung einzufrieren. Die erwartete Ex-vivo-Expansionsphase beträgt 3-4 Wochen. Die Reinigung und Isolierung basiert auf einem Protokoll, das zuvor für die klinische Verwendung genehmigt wurde.

Für die Injektion erforderliche MSC-Menge Basierend auf veröffentlichten Tierstudien variiert die bei Xerostomie verabreichte Menge an Mäusen von 2 x 105 bis 2 x 106 [19]. Um diese Mausdaten auf eine realistische Dosis beim Menschen umzurechnen, haben wir basierend auf den folgenden Daten extrapoliert: Die Volumendichte der submandibulären Drüsen nähert sich sehr genau 1 (1,06-1,07 mg/mm3) [27]. In den Mäusestudien zur Strahlentherapie betrug das mittlere Drüsengewicht ungefähr 350 mg, was einem ungefähren Volumen von 350 mm3 entspricht. Daher ist die Mausdosis pr. Drüsenvolumen beträgt etwa 286.000-2.860.000 Zellen Pr. cm3 Drüse (bei Berechnung von entweder 1 x 105 bis 1 x 106). Das Volumen der submandibulären Drüse bei Menschen nach Strahlentherapie beträgt 6,6–7,9 cm3 [28]. Dies entspricht ungefähr einer Dosis pr. Patient zwischen 1,9 x 106 bis 2,2 x 106 oder 1,9 x 107 bis 2,2 x 107 Zellen pr. Unterkieferspeicheldrüse. Aus den obigen Annahmen und um nicht zu wenige Zellen zu geben, haben wir uns entschieden, mit der maximalen Dosis fortzufahren, die 2,8 * 10 ^ 6 MSC/cm ^ 3 Drüse entspricht, d.h. eine maximale Gesamtdosis pro Patient von ungefähr 4,6 * 10 ^7 MSCs. Um jedoch die den Patienten verabreichte Dosis zu standardisieren, wird die verabreichte Menge wie unten beschrieben auf die Größe ihrer Unterkieferdrüsen standardisiert.

Injektion von MSCs in Submandibulardrüsen Die Probanden werden für stationäre Eingriffe in die HNO-Abteilung, Sektion 2073, gebracht. Der chirurgische Eingriff erfolgt unter örtlicher Betäubung unter Ultraschallführung und steriler Technik. Nach Erhalt der MSC-Suspension oder Placebo-Suspension identifiziert der Chirurg die submandibulären Drüsen und injiziert die Suspensions-MSCs. Berechnung der injizierten Anzahl von MSCs pr. Teilnehmer stützt sich auf folgende Berechnung: , wobei Volumen das Volumen der Glandula submandibularis ist und ein Drüsenvolumen von ca. 7-8 cm3 sind die Norm. Daher beträgt die Menge an Zellen, die jedem Teilnehmer gegeben werden, ca. insgesamt. Anschließend erhält der Teilnehmer ein Pflaster und rezeptfreie Analgetika. Die MSCs werden in isotonischer NaCl (0,9 mg/ml) und Humanalbumin (HA) 1 % auf ein Endvolumen von 2 ml suspendiert. Placebo besteht aus 2 ml isotonischer NaCl (0,9 mg/ml) und HA 1 %.

Nach 3-4 Wochen und 3-4 Monaten postoperativ wird ein Kontroll-MRT der Empfängerstelle durchgeführt. Die MRT dient der Volumenbestimmung der Speicheldrüsen und der Kontrolle des Empfängerortes.

Nach 3-4 Monaten wird zufällig eine kleine Biopsie aus einer der beiden Speicheldrüsen entnommen. Der Eingriff erfolgt unter örtlicher Betäubung. Die Histologie wird bestimmt (die Proben werden dem Pathologen gegenüber verblindet).

Wenn die abschließende MRT, Biopsie und Speichelfunktionstest durchgeführt wurden ca. 3-4 Monate nach Abschluss der behandlungsspezifischen studienbezogenen Tests und Aktivitäten. Um späte Komplikationen oder späte unerwünschte Ereignisse zu erkennen, werden alle Studienteilnehmer, die eine MSC-Behandlung erhalten haben, 1 Jahr und 3 Jahre nach der Behandlung zu einer Kontrolluntersuchung eingeladen.

Sicherheit, Isolierung und Vermehrung von MSC personelle und betriebliche Ressourcen zur Herstellung von MSCs gemäß guter Herstellungspraxis (GMP).

Das MSC-Produkt wird mittels Durchflusszytometrie auf anerkannte Oberflächenmarker (CD73, CD90, CD105) getestet und vor der endgültigen Freigabe allgemeinen Qualitätskontrollen unterzogen (Zellviabilität und Tests auf Mikroorganismen). Für die Kultivierung der MSC werden wir anstelle der bisherigen Verwendung von tierischem Serum (fetales Rinderserum, FBS) Basalmedium verwenden, das mit humanem Thrombozytenlysat von gesunden Blutspendern ergänzt ist. Dies hat die folgenden Vorteile: 1) Keine Wahrscheinlichkeit einer Transfektion sowohl bekannter als auch unbekannter Tierpathogene oder Risiko einer Xeno-Immunisierung 50 gesunde Spender.

Die gesamte Ernte, Isolierung, Expansion usw. von MSC erfolgt in Übereinstimmung mit den GMP-Vorschriften. Die Blutbank verfügt über Reinraumeinrichtungen, die von der dänischen Gesundheits- und Arzneimittelbehörde für GMP-konforme Zellexpansion für den klinischen Gebrauch zugelassen sind, und alle Studien werden von speziell geschultem Personal durchgeführt.

Beurteilung der Xerostomie und des subjektiven Behandlungsergebnisses Die subjektive Wirkung der Behandlung wird anhand einer vom Patienten ausgefüllten visuellen Xerostomie-Analogskala von 100 mm [31] und eines ärztlich bewerteten Fragebogens [32] beurteilt, die beide vor und nach der Behandlung durchgeführt wurden Behandlung. Jeder Teilnehmer wird auch nach täglichen Symptomen von Mundtrockenheit gemäß der UKU-Nebenwirkungsbewertungsskala Punkt 3.3 [29] gefragt. Diese Skala umfasst vier Bewertungen, wobei 0 kein Gefühl von Mundtrockenheit bezeichnet, 1 ein leichtes Gefühl von Mundtrockenheit bezeichnet, 2 ein starkes Gefühl von Mundtrockenheit bezeichnet und 3 ein unangenehmes Gefühl von Mundtrockenheit bezeichnet, das das Sprechen und Essen erschwert.

Beurteilung der Speichelflussrate und objektiver Behandlungserfolg Die Veränderung der Sekretionsrate des unstimulierten Gesamtspeichels in der Mundhöhle ist wahrscheinlich der wichtigste Parameter für die biologische Entstehung einer Xerostomie und begleitender pathologischer Munderkrankungen. Der gesamte Speichel, z. B. die gemischten Sekrete der großen und kleinen Speicheldrüsen, wird in der Mundhöhle gemischt. Eine korrekte Bestimmung dieses Wertes ist entscheidend für die Beurteilung des Behandlungsergebnisses in diesem Projekt. Zur Beurteilung des Speichelflusses wird zwischen 9 und 12 Uhr Vollspeichel gesammelt. Die Probanden verzichten 2 Stunden vor der Entnahme auf Essen, Trinken, Rauchen und Mundhygiene. Nachdem sie aufrecht auf einem Stuhl sitzen, entspannen sie sich für 5 min und werden dann angewiesen, während der Entnahme so wenig Bewegungen wie möglich zu machen, einschließlich Schlucken.

Vor und nach der Behandlung wird unstimulierter Vollspeichel mit der Spuckmethode [33] gesammelt, bei der die Teilnehmer ihren Speichel über einen Zeitraum von 15 Minuten in einen Sammelbehälter spucken. Die Speichelflussrate (SFR) (ml/min) wird als Gewichtszunahme des Behälters dividiert durch die Sammelzeit in Minuten bestimmt.

Nach dem Sammeln von unstimuliertem Speichel werden die Probanden angewiesen, auf 1 g sterilem Paraffinwachs zu kauen. Sie werden gebeten, während des Kauens den Mund geschlossen zu halten und Schlucken zu vermeiden. Alle 60 Sekunden werden sie aufgefordert, in einen neuen Speichelsammler zu spucken, bevor sie eine neue Kauperiode beginnen. Dies wird für 5 min wiederholt.

Zur Beurteilung des Behandlungsergebnisses der Glandula submandibularis wird Speichel in unstimuliertem und stimuliertem Zustand auch direkt vom Mundboden gesammelt. Die unstimulierte Gesamtspeichelflussrate der Glandula submandibularis wird durch die Abstrichmethode mit Watterollen beurteilt, die bukkal in jedem Bereich der oberen Molaren und unter der Zunge auf dem Mundboden platziert werden. Unmittelbar vor Beginn der Entnahme wird zum Schlucken aufgefordert, falls dies nicht möglich ist, wird der Speichel mit einer Pipette entnommen. Das Sammeln erfolgt in zwei aufeinanderfolgenden Perioden von 3 Minuten und am Ende jeder Periode werden das Kinn und die Lippen mit einer Serviette abgewischt. Die Speichelflussraten werden nach Gewicht bestimmt (1 g entspricht 1 ml Speichel), wobei Rollen und Servietten vor der Entnahme gewogen und danach erneut gewogen werden. Die Durchflussraten werden als Gewichtszunahme während des Sammelns berechnet und in Millilitern pro Minute ausgedrückt. Speichel aus den Watterollen wird durch Zentrifugation (1500g) extrahiert und auf seine Zusammensetzung analysiert. Dieser stimulierte Sammelprozess wird anschließend mit zitrushaltigen Brötchen durchgeführt, um die Unterkieferdrüsen maximal zu stimulieren. Von jeder dieser Speichelsammlungen wird Speichel aliquotiert und bei –80°C gelagert.

Chemische Analyse des Speichels Vollständiger Speichel enthält eine große Anzahl von Bakterien und Epithelzellen sowie Zahnfleischtaschenflüssigkeit. Daher ist Vollspeichel normalerweise nicht für die Analyse sensibler chemischer Parameter geeignet. Dafür eignet sich der selektiv gesammelte Speichel aus einzelnen Drüsen wesentlich besser. Daher können die meisten Analysen sowohl aus Parotis- als auch Submandibulardrüsen-/Sublingualisspeichel durchgeführt werden. Die folgenden Analysen werden mit dem gesammelten Speichel durchgeführt: pH und Bikarbonat durch Schätzung des Ionengleichgewichts [34], Natrium, Kalium, Kalzium, Phosphat, Chlorid und Fluorid [35], Gesamtprotein und ausgewählte Proteine ​​[36] und Amylase [37] . Der Zweck der Studien besteht darin, zu beurteilen, ob sich der Speichel nach der Behandlung normalisiert, und somit eine Schätzung der Schutzkapazität des Speichels für Zähne und Schleimhäute vor und nach der Behandlung bereitzustellen.

Datenerhebung und -analyse Quelldaten: Es wird eine Quelldokumentation für alle Daten im Case Report Form (CRF) geben.

Der Studienleiter gewährt direkten Zugriff auf Studiendaten und Studiendokumente für die Überwachung, Prüfung und Inspektion durch die Wissenschaftsethikkommission, die dänische Gesundheits- und Arzneimittelbehörde oder ähnliche Behörden in anderen Ländern. Für die Verarbeitung personenbezogener Daten gemäß dem dänischen Datenschutzgesetz wird eine Genehmigung von der Datenschutzbehörde eingeholt. Anträge werden über das Rechtssekretariat Rigshospitalet gestellt.