Mesenkymala stamceller för strålningsinducerad Xerostomi (MESRIX)

Design Randomiserat, kontrollerat försök med blindning. För att upprätthålla tilldelningsdöljande kommer alla deltagare, vårdgivare, försöksutredare och resultatbedömare förutom Blodbankspersonalen att bli blinda för interventionen. Personal från Blodbanken kommer inte att ha direktkontakt med patienterna (hädanefter deltagarna) som sådana.

Projektplan För inkludering i studien kommer deltagarna att få sin vanliga sjukdomshistoria tagen enligt riktlinjer från Öron-, näs- och halskirurgiska avdelningen, Köpenhamns Universitetssjukhus Rigshospitalet.

Alla deltagare kommer att genomgå en mini-läppsugning, från vilken MSC:er kommer att expanderas ex vivo i en god tillverkningssed (GMP)-godkänd renrumsanläggning (The Blood Bank, avsnitt 2014). När cellerna anländer till blodbanken kommer deltagarna att randomiseras till antingen ex vivo-expansion av sina mesenkymala stamceller eller att få dem frysta för eventuell senare användning. Förväntad ex vivo expansionsfas är 3-4 veckor. Reningen och isoleringen kommer att baseras på ett protokoll som tidigare godkänts för klinisk användning.

Mängden MSC som krävs för injektion Baserat på publicerade djurstudier varierar mängden som ges för xerostomi till möss från 2 x 105 till 2 x 106 [19]. För att omvandla dessa mössdata till en realistisk dos hos människor har vi extrapolerat baserat på följande data: Volymdensiteten för submandibulära körtlar är mycket nära 1 (1,06-1,07) mg/mm3) [27]. I mössstudierna på strålbehandling var den genomsnittliga körtelvikten cirka 350 mg, vilket motsvarar en ungefärlig volym på 350 mm3. Därför musdosen pr. körtelvolymen är cirka 286.000-2.860.000 celler pr. cm3 körtel (beräknat från antingen 1 x 105 till 1 x 106). Volymen av den submandibulära körteln hos människor efter strålbehandling är 6,6-7,9 cm3 [28]. Detta motsvarar en ungefärlig dos pr. patient med mellan 1,9 x 106 till 2,2 x 106, eller 1,9 x 107 till 2,2 x 107 celler pr. submandibulär körtel. Utifrån ovanstående antaganden och för att inte ge till få celler har vi valt att fortsätta med den maximala dosen motsvarande 2,8*10^6 MSC/cm^3 körtel, dvs en maximal total dos per patient på cirka 4,6 * 10 ^7 MSC:er. Men för att standardisera dosen som ges till patienterna, kommer mängden som ges standardiseras till storleken på deras submandibulära körtlar, enligt beskrivningen nedan.

Injektion av MSC i submandibulära körtlar Försökspersonerna kommer att gå till ÖNH-avdelningen, sektion 2073 för slutenvård. Det kirurgiska ingreppet görs under lokalbedövning med hjälp av ultraljudsvägledning och steril teknik. Efter att ha mottagit MSC-suspensionen eller placebo-suspensionen kommer kirurgen att identifiera de submandibulära körtlarna och injicera suspensionens MSC. Beräkning av injicerat antal MSCs pr. deltagaren vilar på följande beräkning: , där volym är volymen av den submandibulära körteln, och en körtelvolym på ca. 7-8cm3 är normen. Därför kommer antalet celler som ges till varje deltagare att vara ca. totalt. Efteråt får deltagaren ett plåster och receptfria smärtstillande medel. MSC:erna kommer att suspenderas i isotonisk NaCl (0,9 mg/ml) och humant albumin (HA) 1 % till en slutlig volym på 2 ml. Placebo kommer att vara 2 ml isotonisk NaCl (0,9 mg/ml) och HA 1 %.

Uppföljning MRT av mottagarplatsen kommer att utföras efter 3-4 veckor och 3-4 månader postoperativt. MRT används för volymbestämning av spottkörtlar och kontroll av mottagarplats.

Efter 3-4 månader tas en liten biopsi slumpmässigt från en av de två spottkörtlarna. Ingreppet sker under lokalbedövning. Histologi bestäms (prover är förblindade för patologen).

När slutlig MRT, biopsi och salivfunktionstest är utfört ca. 3-4 månader efter behandlingen avslutas specifika studierelaterade tester och aktiviteter. För att upptäcka sena komplikationer eller sena biverkningar inbjuds alla studiedeltagare som fått MSC-behandling till en kontroll 1 år och 3 år efter behandlingen.

Säkerhet, isolering och spridning av MSC. Blodbanken har sitt cellvävnadsgodkännande från den danska hälso- och medicinmyndigheten (enligt den danska vävnadslagen), samt ett tillstånd från tillverkare/importör avseende humanläkemedel, nödvändiga fysiska faciliteter, personal och operativa resurser för att producera MSCs i enlighet med god tillverkningssed (GMP).

MSC-produkten kommer att testas för erkända ytmarkörer (CD73, CD90, CD105) med flödescytometri och genomgå allmänna kvalitetskontroller innan den slutliga frisättningen (cellviabilitet och tester för mikroorganismer). När det gäller odlingen av MSC kommer vi att använda basalt medium kompletterat med humant blodplättslysat från friska blodgivare istället för den tidigare användningen av animaliskt serum (fetalt bovint serum, FBS). Detta har följande fördelar: 1) Ingen sannolikhet för transfektion av både kända och okända djurpatogener, eller risk för xeno-immunisering 2) Liten batch-till-batch variation och därmed mer konsekvent tillväxtprestanda, eftersom varje grupp är beredd från ca. 50 friska donatorer.

All skörd, isolering, expansion etc. av MSC kommer att ske i enlighet med GMP-reglerna. Blodbanken har renrumsfaciliteter som godkänts av den danska hälso- och medicinmyndigheten för GMP-kompatibel cellexpansion för klinisk användning, och alla studier kommer att utföras av specialutbildad personal.

Bedömning av xerostomi och subjektivt behandlingsresultat Den subjektiva effekten av behandlingen bedöms genom en 100 mm visuell analog skala av xerostomi ifylld av patienten [31] och ett läkarebedömt frågeformulär [32], både före och efter behandling. Varje deltagare kommer också att tillfrågas om dagliga symtom på muntorrhet enligt UKU biverkningsskala punkt 3.3 [29]. Denna skala innehåller fyra poäng där 0 anger ingen känsla av muntorrhet, 1 anger en lätt känsla av muntorrhet, 2 anger en svår känsla av muntorrhet och 3 anger besvärlig känsla av muntorrhet som gör tal och ätande svårt.

Bedömning av salivflödeshastighet och objektivt behandlingsresultat Förändringar i utsöndringshastigheten av den ostimulerade hela saliven i munhålan är förmodligen den viktigaste parametern för den biologiska utvecklingen av xerostomi och åtföljande patologiska orala tillstånd. Hel saliv, t.ex. blandade sekret från de större och mindre spottkörtlarna, blandas i munhålan. En korrekt bestämning av detta värde är avgörande för bedömningen av behandlingsresultatet i detta projekt. För bedömning av salivflödeshastigheten kommer hel saliv att samlas in mellan kl. 9 och 12. Försökspersoner kommer att avstå från att äta, dricka, röka och munhygien i 2 timmar före insamlingen. Efter att ha satt sig upprätt i en stol slappnar de av i 5 min och instrueras sedan att göra så få rörelser som möjligt, inklusive svälja, under insamlingen.

Före och efter behandlingen kommer ostimulerad hel saliv att samlas upp med spottmetoden [33] där deltagarna spottar sin saliv i en uppsamlingsbehållare under en period av 15 minuter. Salivflödeshastigheten (SFR) (ml/min) bestäms som viktökningen av behållaren dividerat med uppsamlingstiden i minuter.

Efter insamling av ostimulerad saliv instrueras försökspersonerna att tugga på 1 g sterilt paraffinvax. De kommer att uppmanas att hålla munnen stängd under tuggning och att undvika att svälja. Var 60:e sek kommer de att bli ombedda att spotta i en ny salivuppsamlare innan en ny tuggperiod påbörjas. Detta kommer att upprepas i 5 min.

För att bedöma behandlingsresultatet av de submandibulära körtlarna, samlas saliv också upp direkt från munbotten i ett ostimulerat och stimulerat tillstånd. Den ostimulerade hela salivflödeshastigheten för de submandibulära körtlarna kommer att bedömas med pinnmetoden med bomullsrullar placerade buckalt i varje maxillär molar region och under tungan på golvet i munnen. Omedelbart innan insamlingen påbörjas kommer de att uppmanas att svälja, om detta inte är möjligt kommer saliv att extraheras med en pipett. Samlingen sker under två efterföljande perioder på 3 minuter och i slutet av varje period kommer hakan och läpparna att torkas av med en servett. Salivflödeshastigheter bestäms efter vikt (1 g motsvarar 1 ml saliv) med rullar och servetter vägda före uppsamling och återvägda efter. Flödeshastigheterna beräknas som viktökningen under uppsamlingen och uttrycks som milliliter per minut. Saliv från bomullsrullarna kommer att extraheras genom centrifugering (1500g) och analyseras för dess sammansättning. Denna stimulerade uppsamlingsprocess kommer att utföras efteråt med citrusinnehållande rullar för att stimulera de submandibulära körtlarna maximalt. Från var och en av dessa samlingar av saliv kommer saliv att alikvoteras och lagras vid -800°C.

Kemisk analys av saliv Hel saliv innehåller ett stort antal bakterier och epitelceller, samt gingival crevikulär vätska. Därför är hel saliv normalt inte lämpad för analys av känsliga kemiska parametrar. För detta ändamål är den selektivt uppsamlade saliven från enskilda körtlar mycket bättre. Som ett resultat kan majoriteten av analyserna utföras från antingen parotis och submandibulär körtel/sublingualis saliv. Följande analyser kommer att utföras på den uppsamlade saliven: pH och bikarbonat genom jonbalansuppskattning [34], natrium, kalium, kalcium, fosfat, klorid och fluorid [35], totalt protein och utvalda proteiner [36] och amylas [37] . Syftet med studierna är att utvärdera om saliv kommer att normaliseras efter behandling och därmed ge en uppskattning av salivens tand- och slemhinneskyddande förmåga före och efter behandling.

Datainsamling och analys Källdata: Det kommer att finnas källdokumentation för all data i Case Report Form (CRF).

Studieledaren ger direkt tillgång till studiedata och studiedokument för övervakning, revision och inspektion av den vetenskapsetiska kommittén, den danska hälso- og sjukvårdsstyrelsen eller liknande myndigheter i andra länder. Tillstånd kommer att begäras från DPA för behandling av personuppgifter enligt den danska dataskyddslagen. Ansökningar skickas via juridiska sekretariatet, Rigshospitalet.