Cellules souches mésenchymateuses pour la xérostomie radio-induite (MESRIX)

Conception Essai contrôlé randomisé en aveugle. Pour maintenir la dissimulation de l'attribution, tous les participants, les soignants, les enquêteurs de l'essai et les évaluateurs des résultats, à l'exception du personnel de la banque de sang, ne seront pas informés de l'intervention. Le personnel de la banque de sang n'aura pas de contact direct avec les patients (ci-après les participants) en tant que tels.

Plan du projet Pour être inclus dans l'étude, les antécédents médicaux habituels des participants seront relevés conformément aux directives du département de chirurgie de l'oreille, du nez et de la gorge de l'hôpital universitaire de Copenhague Rigshospitalet.

Tous les participants subiront une mini-aspiration des lèvres, à partir de laquelle les MSC seront étendus ex vivo dans une installation de salle blanche approuvée par les bonnes pratiques de fabrication (BPF) (The Blood Bank, section 2014). Lorsque les cellules arriveront à la banque de sang, les participants seront randomisés pour soit l'expansion ex vivo de leurs cellules souches mésenchymateuses, soit les faire congeler pour une utilisation ultérieure potentielle. La phase d'expansion ex vivo prévue est de 3 à 4 semaines. La purification et l'isolement seront basés sur un protocole préalablement approuvé pour une utilisation clinique.

Quantité de CSM requise pour l'injection Sur la base d'études animales publiées, la quantité administrée pour la xérostomie aux souris varie de 2 x 105 à 2 x 106 [19]. Pour convertir ces données de souris en une dose réaliste chez l'homme, nous avons extrapolé sur la base des données suivantes : La densité volumique des glandes sous-maxillaires se rapproche très étroitement de 1 (1,06-1,07 mg/mm3) [27]. Dans les études de souris sur la radiothérapie, le poids moyen des glandes était d'environ 350 mg, ce qui correspond à un volume approximatif de 350 mm3. Par conséquent, la dose de souris pr. le volume des glandes est d'environ 286.000-2.860.000cellules pr. presse-étoupe cm3 (calculé de 1 x 105 à 1 x 106). Le volume de la glande sous-maxillaire chez les sujets humains après radiothérapie est de 6,6 à 7,9 cm3 [28]. Cela correspond à une dose approximative pr. patient de 1,9 x 106 à 2,2 x 106, ou 1,9 x 107 à 2,2 x 107 cellules pr. glande sous-maxillaire. Partant des hypothèses ci-dessus et afin de ne pas donner à peu de cellules nous avons choisi de procéder à la dose maximale correspondant à 2,8*10^6 MSC/cm^3 glande, soit une dose totale maximale par patient d'environ 4,6 * 10 ^ 7 MSC. Cependant, pour standardiser la dose administrée aux patients, la quantité administrée sera standardisée en fonction de la taille de leurs glandes sous-maxillaires, comme décrit ci-dessous.

Injection de CSM dans les glandes sous-maxillaires Les sujets iront au service ORL, section 2073 pour les procédures d'hospitalisation. L'intervention chirurgicale se fait sous anesthésie locale sous guidage ultrasonique et technique stérile. Après avoir reçu la suspension MSC ou la suspension placebo, le chirurgien identifiera les glandes sous-maxillaires et injectera les MSC en suspension. Calcul du nombre injecté de MSCs pr. participant repose sur le calcul suivant : , où le volume est le volume de la glande sous-maxillaire, et un volume de glande d'env. 7-8cm3 est la norme. Par conséquent, le nombre de cellules attribuées à chaque participant sera app. au total. Ensuite, le participant recevra un pansement et des analgésiques en vente libre. Les CSM seront mises en suspension dans du NaCl isotonique (0,9 mg/ml) et de l'albumine humaine (HA) à 1 % jusqu'à un volume final de 2 ml. Le placebo sera 2ml de NaCl isotonique (0,9mg/ml) et HA 1%.

Une IRM de suivi du lieu receveur sera effectuée après 3-4 semaines et 3-4 mois après l'opération. L'IRM est utilisée pour la détermination du volume des glandes salivaires et le contrôle de l'endroit du receveur.

Après 3-4 mois, une petite biopsie est prélevée au hasard sur l'une des deux glandes salivaires. La procédure se déroule sous anesthésie locale. L'histologie est déterminée (les échantillons sont ignorés du pathologiste).

Lorsque l'IRM finale, la biopsie et le test de la fonction salivaire ont été effectués env. 3-4 mois après la fin des tests et des activités liés à l'étude spécifique au traitement. Pour détecter les complications tardives ou les événements indésirables tardifs, tous les participants à l'étude qui ont reçu un traitement par MSC sont invités à un contrôle 1 an et 3 ans après le traitement.

Sécurité, isolement et propagation de MSC La banque de sang a son approbation de tissus cellulaires de l'Autorité danoise de la santé et des médicaments (conformément à la loi danoise sur les tissus), ainsi qu'une autorisation de fabricant/importateur concernant les médicaments à usage humain, les installations physiques nécessaires, personnel et des ressources opérationnelles pour produire des MSC conformément aux bonnes pratiques de fabrication (BPF).

Le produit MSC sera testé pour les marqueurs de surface reconnus (CD73, CD90, CD105) par cytométrie en flux, et subira des contrôles de qualité généraux avant la libération finale (viabilité cellulaire et tests de micro-organismes). En ce qui concerne la culture du MSC, nous utiliserons un milieu de base additionné de lysat de plaquettes humaines provenant de donneurs de sang sains au lieu de l'ancienne utilisation de sérum d'origine animale (sérum bovin fœtal, FBS). Cela présente les avantages suivants : 1) Aucune probabilité de transfection d'agents pathogènes animaux connus et inconnus, ou risque de xéno-immunisation 2) Petite variation d'un lot à l'autre et donc une performance de croissance plus constante, puisque chaque groupe est préparé à partir d'env. 50 donneurs sains.

Toutes les récoltes, isolements, expansions, etc. de MSC seront conformes aux réglementations GMP. La banque de sang dispose d'installations de salle blanche approuvées par l'Autorité danoise de la santé et des médicaments pour l'expansion cellulaire conforme aux BPF à usage clinique, et toutes les études seront effectuées par du personnel spécialement formé.

Évaluation de la xérostomie et résultat subjectif du traitement L'effet subjectif du traitement est évalué par une échelle visuelle analogique de xérostomie de 100 mm remplie par le patient [31] et un questionnaire évalué par le médecin [32], tous deux réalisés avant et après traitement. Chaque participant sera également interrogé sur les symptômes quotidiens de la bouche sèche selon l'élément 3.3 de l'échelle d'évaluation des effets secondaires de l'UKU [29]. Cette échelle comprend quatre scores où 0 indique aucune sensation de bouche sèche, 1 indique une légère sensation de bouche sèche, 2 indique une sensation sévère de bouche sèche et 3 indique une sensation gênante de bouche sèche qui rend la parole et l'alimentation difficiles.

Évaluation du débit salivaire et résultat objectif du traitement Les modifications du taux de sécrétion de la salive entière non stimulée dans la cavité buccale sont probablement le paramètre le plus important pour le développement biologique de la xérostomie et des affections buccales pathologiques qui l'accompagnent. La salive entière, par exemple les sécrétions mixtes des glandes salivaires majeures et mineures, est mélangée dans la cavité buccale. Une détermination correcte de cette valeur est cruciale pour l'évaluation des résultats du traitement dans ce projet. Pour l'évaluation du débit salivaire, la salive entière sera prélevée entre 9h et 12h. Les sujets s'abstiendront de manger, de boire, de fumer et d'hygiène buccale pendant 2 heures avant la collecte. Après avoir été assis bien droit sur une chaise, ils se détendent pendant 5 minutes et sont ensuite invités à faire le moins de mouvements possible, y compris la déglutition, pendant le prélèvement.

Avant et après le traitement, la salive entière non stimulée sera collectée en utilisant la méthode du crachat [33] où les participants crachent leur salive dans un récipient de collecte sur une période de 15 minutes. Le débit salivaire (SFR) (ml/min) est déterminé comme l'augmentation de poids du récipient divisée par le temps de prélèvement en minutes.

Après la collecte de salive non stimulée, les sujets sont invités à mâcher 1 g de cire de paraffine stérile. Il leur sera demandé de garder la bouche fermée pendant la mastication et d'éviter d'avaler. Toutes les 60 secondes, il leur sera demandé de cracher dans un nouveau collecteur de salive avant de commencer une nouvelle période de mastication. Ceci sera répété pendant 5 min.

Pour évaluer le résultat du traitement des glandes sous-maxillaires, la salive est également prélevée directement du plancher de la bouche dans un état non stimulé et stimulé. Le débit de salive entière non stimulée des glandes sous-maxillaires sera évalué par la méthode de l'écouvillon avec des rouleaux de coton placés en bouche dans chaque région molaire maxillaire et sous la langue sur le plancher de la bouche. Immédiatement avant le début du prélèvement, il leur sera demandé d'avaler, si cela n'est pas possible, la salive sera extraite à l'aide d'une pipette. Le prélèvement s'effectue pendant deux périodes consécutives de 3 min et, à la fin de chaque période, le menton et les lèvres seront essuyés avec une serviette. Les débits de salive sont déterminés en fonction du poids (1 g équivaut à 1 ml de salive) avec des rouleaux et des serviettes pesés avant le prélèvement et repesés après. Les débits sont calculés comme l'incrément de poids lors de la collecte et exprimés en millilitres par minute. La salive des rouleaux de coton sera extraite par centrifugation (1500g) et analysée pour sa composition. Ce processus de collecte stimulée sera ensuite effectué avec des rouleaux contenant des agrumes pour stimuler au maximum les glandes sous-maxillaires. De chacune de ces collections de salive, la salive sera aliquotée et stockée à -80°C.

Analyse chimique de la salive La salive entière contient un grand nombre de bactéries et de cellules épithéliales, ainsi que du liquide créviculaire gingival. Par conséquent, la salive entière n'est normalement pas adaptée à l'analyse de paramètres chimiques sensibles. À cette fin, la salive collectée sélectivement à partir de glandes individuelles est bien meilleure. En conséquence, la majorité des analyses peuvent être effectuées à partir de la glande parotide et sous-maxillaire / de la salive sublinguale. Les analyses suivantes seront effectuées sur la salive collectée : pH et bicarbonate par estimation de la balance ionique [34], sodium, potassium, calcium, phosphate, chlorure et fluorure [35], protéines totales et protéines sélectionnées [36] et amylase [37] . Le but des études est d'évaluer si la salive sera normalisée après traitement, et ainsi de fournir une estimation de la capacité de protection dentaire et muqueuse de la salive avant et après traitement.

Collecte et analyse des données Données sources : Il y aura une documentation source pour toutes les données dans le formulaire de rapport de cas (CRF).

Le directeur de l'étude permet un accès direct aux données et aux documents de l'étude pour le suivi, l'audit et l'inspection du comité d'éthique scientifique, de l'autorité danoise de la santé et des médicaments ou d'autorités similaires dans d'autres pays. Une autorisation sera demandée à la DPA pour le traitement des données personnelles en vertu de la loi danoise sur la protection des données. Les candidatures seront envoyées via le secrétariat juridique, Rigshospitalet.