Células-tronco mesenquimais para xerostomia induzida por radiação (MESRIX)

Desenho Ensaio randomizado, controlado com cegamento. Para manter o sigilo da alocação, todos os participantes, cuidadores, investigadores do estudo e avaliadores de resultados, exceto a equipe do Banco de Sangue, não terão conhecimento da intervenção. Os funcionários do Banco de Sangue não terão contato direto com os pacientes (doravante os participantes) como tal.

Plano do projeto Para inclusão no estudo, os participantes terão seu histórico médico usual obtido de acordo com as diretrizes do Departamento de Cirurgia de Ouvido, Nariz e Garganta do Hospital Rigshospitalet da Universidade de Copenhague.

Todos os participantes passarão por uma mini-sucção labial, a partir da qual as MSCs serão expandidas ex vivo em uma instalação de sala limpa aprovada por boas práticas de fabricação (GMP) (The Blood Bank, seção 2014). Quando as células chegarem ao Banco de Sangue, os participantes serão randomizados para a expansão ex vivo de suas células-tronco mesenquimais ou para seu congelamento para possível uso posterior. A fase de expansão ex vivo esperada é de 3-4 semanas. A purificação e isolamento serão baseados em um protocolo previamente aprovado para uso clínico.

Quantidade de MSCs necessária para injeção Com base em estudos publicados em animais, a quantidade administrada para xerostomia em camundongos varia de 2 x 105 a 2 x 106 [19]. Para converter esses dados de camundongos em uma dose realista em humanos, extrapolamos com base nos seguintes dados: A densidade de volume das glândulas submandibulares se aproxima muito de 1 (1,06-1,07 mg/mm3) [27]. Nos estudos de radioterapia em camundongos, o peso médio da glândula foi de aproximadamente 350mg, o que corresponde a um volume aproximado de 350mm3. Portanto, a dose de camundongo pr. o volume da glândula é de aproximadamente 286.000-2.860.000células pr. glândula cm3 (quando calculado de 1 x 105 a 1 x 106). O volume da glândula submandibular em seres humanos após a radioterapia é de 6,6-7,9 cm3 [28]. Isso corresponde a uma dose aproximada pr. paciente entre 1,9 x 106 a 2,2 x 106, ou 1,9 x 107 a 2,2 x 107 células pr. glândula submandibular. A partir dos pressupostos acima e para não dar a poucas células optamos por proceder com a dose máxima correspondente a 2,8*10^6 MSC/cm^3 glândula, ou seja, uma dose máxima total por paciente de aproximadamente 4,6 * 10 ^7 MSCs. Porém, para padronizar a dose administrada aos pacientes, a quantidade administrada será padronizada de acordo com o tamanho de suas glândulas submandibulares, conforme descrito a seguir.

Injeção de MSCs nas glândulas submandibulares Os indivíduos irão para o departamento de otorrinolaringologia, seção 2073 para procedimentos de internação. O procedimento cirúrgico é feito sob anestesia local usando orientação ultrassônica e técnica estéril. Depois de receber a suspensão de MSC ou suspensão de placebo, o cirurgião identificará as glândulas submandibulares e injetará as MSCs de suspensão. Cálculo do número injetado de MSCs pr. O participante baseia-se no seguinte cálculo: , onde volume é o volume da glândula submandibular, e uma glândula-volume de app. 7-8cm3 é a norma. Portanto, a quantidade de células dadas a cada participante será app. no total. Em seguida, o participante receberá um band-aid e analgésicos de venda livre. As MSCs serão suspensas em NaCl Isotônico (0,9 mg/ml) e Albumina Humana (HA) 1% até um volume final de 2ml. Placebo será 2ml de NaCl Isotônico (0,9mg/ml) e HA 1%.

A ressonância magnética de acompanhamento do local receptor será realizada após 3-4 semanas e 3-4 meses após a cirurgia. A RM é utilizada para determinação do volume das glândulas salivares e controle do local receptor.

Após 3-4 meses, uma pequena biópsia é retirada aleatoriamente de uma das duas glândulas salivares. O procedimento ocorre sob anestesia local. A histologia é determinada (as amostras são cegas para o patologista).

Quando a ressonância magnética final, a biópsia e o teste de função salivar tiverem sido realizados aprox. 3-4 meses após o tratamento, os testes e atividades relacionados ao estudo específico são concluídos. Para detectar complicações tardias ou eventos adversos tardios, todos os participantes do estudo que receberam tratamento para MSC são convidados para um check-up 1 ano e 3 anos após o tratamento.

Segurança, isolamento e propagação de MSC O Banco de Sangue tem sua aprovação de tecido celular da Autoridade Dinamarquesa de Saúde e Medicamentos (de acordo com a Lei Dinamarquesa de Tecidos), bem como uma Autorização do Fabricante/Importador referente a Medicamentos Humanos, as instalações físicas necessárias, pessoal e recursos operacionais para produzir MSCs de acordo com as boas práticas de fabricação (GMP).

O produto MSC será testado para marcadores de superfície reconhecidos (CD73, CD90, CD105,) usando citometria de fluxo e passará por verificações gerais de qualidade antes da liberação final (viabilidade celular e testes para microorganismos). No que diz respeito ao cultivo de MSC, usaremos meio basal suplementado com lisado de plaquetas humanas de doadores de sangue saudáveis, em vez do uso anterior de soro de origem animal (soro fetal bovino, FBS). Isso tem os seguintes benefícios: 1) Nenhuma probabilidade de transfecção de patógenos animais conhecidos e desconhecidos, ou risco de xenoimunização 2) Pequena variação de lote para lote e, portanto, desempenho de crescimento mais consistente, uma vez que cada grupo é preparado a partir de aprox. 50 doadores saudáveis.

Toda colheita, isolamento, expansão, etc. do MSC estará de acordo com os regulamentos GMP. O Banco de Sangue possui instalações de sala limpa aprovadas pela Autoridade Dinamarquesa de Saúde e Medicamentos para expansão celular compatível com GMP para uso clínico, e todos os estudos serão realizados por pessoal especialmente treinado.

Avaliação da xerostomia e resultado subjetivo do tratamento O efeito subjetivo do tratamento é avaliado por uma escala visual analógica de xerostomia de 100 mm preenchida pelo paciente [31] e um questionário avaliado pelo médico [32], ambos realizados antes e depois tratamento. Cada participante também será questionado sobre os sintomas diários de boca seca de acordo com o item 3.3 da escala de avaliação de efeitos colaterais da UKU [29]. Esta escala inclui quatro pontuações onde 0 denota nenhuma sensação de boca seca, 1 denota uma leve sensação de boca seca, 2 denota uma forte sensação de boca seca e 3 denota sensação incômoda de boca seca que dificulta a fala e a alimentação.

Avaliação da taxa de fluxo salivar e resultado objetivo do tratamento Alterações na taxa de secreção da saliva total não estimulada na cavidade oral é provavelmente o parâmetro mais importante para o desenvolvimento biológico da xerostomia e condições orais patológicas associadas. A saliva total, por exemplo, as secreções mistas das glândulas salivares maiores e menores são misturadas na cavidade oral. A determinação correta deste valor é crucial para a avaliação do resultado do tratamento neste projeto. Para avaliação do fluxo salivar, será coletada saliva total entre 9h e 12h. Os indivíduos abster-se-ão de comer, beber, fumar e higiene bucal por 2 horas antes da coleta. Após sentarem-se eretos em uma cadeira, relaxam por 5 minutos e são orientados a fazer o mínimo de movimentos possível, incluindo deglutição, durante a coleta.

Antes e depois do tratamento, a saliva total não estimulada será coletada usando o método de cuspir [33] onde os participantes cuspem sua saliva em um recipiente de coleta por um período de 15 minutos. A taxa de fluxo salivar (SFR) (ml/min) é determinada como o aumento do peso do recipiente dividido pelo tempo de coleta em minutos.

Após a coleta da saliva não estimulada, os sujeitos são instruídos a mastigar 1 g de cera de parafina estéril. Eles serão solicitados a manter a boca fechada durante a mastigação e evitar a deglutição. A cada 60 segundos, eles serão solicitados a cuspir em um novo coletor de saliva antes de iniciar um novo período de mastigação. Isso será repetido por 5 min.

Para avaliar o resultado do tratamento das glândulas submandibulares, a saliva também é coletada diretamente do assoalho da boca em um estado não estimulado e estimulado. A taxa de fluxo de saliva total não estimulada das glândulas submandibulares será avaliada pelo método de swab com rolos de algodão colocados vestibularmente em cada região molar superior e sob a língua no assoalho da boca. Imediatamente antes do início da coleta será solicitado que engula, caso isso não seja possível, a saliva será extraída por uma pipeta. A coleta ocorre em dois períodos subseqüentes de 3 min e, ao final de cada período, o queixo e os lábios serão enxugados com um guardanapo. As taxas de fluxo de saliva são determinadas pelo peso (1 g é igual a 1 ml de saliva) com rolos e guardanapos pesados ​​antes da coleta e pesados ​​novamente após. As taxas de fluxo são calculadas como o incremento em peso durante a coleta e expressas em mililitros por minuto. A saliva dos rolos de algodão será extraída por centrifugação (1500g) e analisada quanto à sua composição. Este processo de coleta estimulada será realizado posteriormente com rolos contendo frutas cítricas para estimular ao máximo as glândulas submandibulares. De cada uma dessas coleções de saliva, a saliva será aliquotada e armazenada a -800C.

Análise química da saliva A saliva inteira contém um grande número de bactérias e células epiteliais, bem como fluido crevicular gengival. Portanto, a saliva total normalmente não é adequada para a análise de parâmetros químicos sensíveis. Para este propósito, a saliva coletada seletivamente de glândulas individuais é muito melhor. Como resultado, a maioria das análises pode ser realizada a partir da glândula parótida e submandibular/saliva sublingual. Na saliva coletada serão realizadas as seguintes análises: pH e bicarbonato por estimativa de balanço iônico [34], sódio, potássio, cálcio, fosfato, cloreto e flúor [35], proteína total e proteínas selecionadas [36] e amilase [37] . O objetivo dos estudos é avaliar se a saliva será normalizada após o tratamento e, assim, fornecer uma estimativa da capacidade de proteção dental e mucosa da saliva antes e após o tratamento.

Coleta e análise de dados Dados de origem: Haverá documentação de origem para todos os dados no Formulário de Relato de Caso (CRF).

O diretor do estudo permite o acesso direto aos dados e documentos do estudo para monitoramento, auditoria e inspeção do Comitê de Ética Científica, da Autoridade Dinamarquesa de Saúde e Medicamentos ou autoridades similares em outros países. A permissão será solicitada ao DPA para o processamento de dados pessoais sob a Lei Dinamarquesa de Proteção de Dados. As candidaturas serão enviadas através do secretariado jurídico, Rigshospitalet.