Cellule staminali mesenchimali per xerostomia indotta da radiazioni (MESRIX)

Progettazione Studio randomizzato e controllato con accecamento. Per mantenere l'occultamento dell'allocazione, tutti i partecipanti, gli operatori sanitari, gli investigatori del processo e i valutatori dei risultati, ad eccezione del personale della Banca del sangue, saranno ciechi all'intervento. Il personale della Banca del sangue non avrà contatti diretti con i pazienti (di seguito i partecipanti) in quanto tali.

Piano del progetto Per l'inclusione nello studio i partecipanti avranno la loro solita storia medica presa secondo le linee guida del dipartimento di chirurgia dell'orecchio, del naso e della gola, Rigshospitalet dell'ospedale universitario di Copenaghen.

Tutti i partecipanti saranno sottoposti a una mini-aspirazione delle labbra, da cui le MSC saranno espanse ex vivo in una struttura per camera bianca approvata dalle buone pratiche di fabbricazione (GMP) (The Blood Bank, sezione 2014). Quando le cellule arrivano alla banca del sangue, i partecipanti verranno randomizzati all'espansione ex vivo delle loro cellule staminali mesenchimali o al loro congelamento per un potenziale uso successivo. La fase di espansione ex vivo prevista è di 3-4 settimane. La purificazione e l'isolamento saranno basati su un protocollo precedentemente approvato per uso clinico.

Quantità di MSC necessarie per l'iniezione Sulla base di studi sugli animali pubblicati, la quantità somministrata per la xerostomia ai topi varia da 2 x 105 a 2 x 106 [19]. Per convertire questi dati sui topi in una dose realistica nell'uomo, abbiamo estrapolato sulla base dei seguenti dati: La densità del volume delle ghiandole sottomandibolari si avvicina molto da vicino a 1 (1,06-1,07 mg/mm3) [27]. Negli studi sui topi in radioterapia il peso medio della ghiandola era di circa 350 mg, che corrisponde a un volume approssimativo di 350 mm3. Pertanto la dose del topo pr. il volume della ghiandola è di circa 286.000-2.860.000 cellule pr. premistoppa cm3 (se calcolato da 1 x 105 a 1 x 106). Il volume della ghiandola sottomandibolare nei soggetti umani dopo la radioterapia è di 6,6-7,9 cm3 [28]. Ciò corrisponde a una dose approssimativa pr. paziente di dimensioni comprese tra 1,9 x 106 e 2,2 x 106 o tra 1,9 x 107 e 2,2 x 107 cellule pr. ghiandola sottomandibolare. Da questi presupposti e per non dare a poche cellule si è scelto di procedere con la dose massima corrispondente a 2.8*10^6 MSC/cm^3 ghiandola, cioè una dose massima totale per paziente di circa 4,6 * 10 ^ 7 MSC. Tuttavia, per standardizzare la dose somministrata ai pazienti, la quantità somministrata sarà standardizzata in base alle dimensioni delle loro ghiandole sottomandibolari, come descritto di seguito.

Iniezione di MSC nelle ghiandole sottomandibolari I soggetti andranno al reparto ORL, sezione 2073 per le procedure ospedaliere. La procedura chirurgica viene eseguita in anestesia locale utilizzando la guida ultrasonica e una tecnica sterile. Dopo aver ricevuto la sospensione MSC o la sospensione placebo, il chirurgo identificherà le ghiandole sottomandibolari e inietterà le MSC sospensione. Calcolo del numero di MSC iniettate pr. partecipante si basa sul seguente calcolo: , dove il volume è il volume della ghiandola sottomandibolare e un volume della ghiandola di app. 7-8 cm3 è la norma. Pertanto la quantità di celle assegnate a ciascun partecipante sarà app. in totale. Successivamente al partecipante verrà somministrato un cerotto e analgesici da banco. Le MSC saranno sospese in NaCl Isotonico (0,9 mg/ml) e Albumina Umana (HA) 1% fino ad un volume finale di 2ml. Il placebo sarà costituito da 2 ml di NaCl isotonico (0,9 mg/ml) e HA 1%.

La risonanza magnetica di follow-up del luogo ricevente verrà eseguita dopo 3-4 settimane e 3-4 mesi dopo l'intervento. La risonanza magnetica viene utilizzata per la determinazione del volume delle ghiandole salivari e il controllo del luogo ricevente.

Dopo 3-4 mesi viene prelevata a caso una piccola biopsia da una delle due ghiandole salivari. La procedura si svolge in anestesia locale. L'istologia è determinata (i campioni sono accecati dal patologo).

Quando la risonanza magnetica finale, la biopsia e il test di funzionalità salivare sono stati eseguiti ca. 3-4 mesi dopo la conclusione dei test e delle attività relativi allo studio specifico del trattamento. Per rilevare complicanze tardive o eventi avversi tardivi, tutti i partecipanti allo studio che hanno ricevuto il trattamento MSC sono invitati a un controllo 1 anno e 3 anni dopo il trattamento.

Sicurezza, isolamento e propagazione delle MSC La banca del sangue ha ottenuto l'approvazione del tessuto cellulare dall'autorità danese per la salute e i medicinali (secondo la legge danese sui tessuti), nonché un'autorizzazione del produttore/importatore per quanto riguarda i medicinali per uso umano, le strutture fisiche necessarie, personale e risorse operative per produrre MSC in conformità con le buone pratiche di fabbricazione (GMP).

Il prodotto MSC sarà testato per marcatori di superficie riconosciuti (CD73, CD90, CD105) mediante citometria a flusso e sottoposto a controlli generali di qualità prima del rilascio finale (vitalità cellulare e test per microrganismi). Per quanto riguarda la coltura delle MSC utilizzeremo terreno basale integrato con lisato piastrinico umano da donatori di sangue sani invece del precedente utilizzo di siero di origine animale (siero bovino fetale, FBS). Ciò ha i seguenti vantaggi: 1) Nessuna probabilità di trasfezione di agenti patogeni animali noti e sconosciuti, o rischio di immunizzazione xeno 2) Piccola variazione da lotto a lotto e quindi prestazioni di crescita più coerenti, poiché ogni gruppo è preparato da ca. 50 donatori sani.

Tutti i raccolti, l'isolamento, l'espansione, ecc. di MSC saranno conformi alle normative GMP. La banca del sangue dispone di camere bianche approvate dall'autorità danese per la salute e i medicinali per l'espansione cellulare conforme alle GMP per uso clinico e tutti gli studi saranno condotti da personale appositamente addestrato.

Valutazione della xerostomia ed esito soggettivo del trattamento L'effetto soggettivo del trattamento è valutato da una scala analogica visiva di 100 mm della xerostomia compilata dal paziente [31] e da un questionario valutato dal medico [32], entrambi eseguiti prima e dopo trattamento. Ad ogni partecipante verrà anche chiesto dei sintomi quotidiani della secchezza delle fauci secondo l'elemento 3.3 della scala di valutazione degli effetti collaterali dell'UKU [29]. Questa scala include quattro punteggi in cui 0 denota nessuna sensazione di secchezza delle fauci, 1 denota una leggera sensazione di secchezza delle fauci, 2 denota una grave sensazione di secchezza delle fauci e 3 denota fastidiosa sensazione di secchezza delle fauci che rende difficile parlare e mangiare.

Valutazione del flusso salivare e risultato oggettivo del trattamento Le variazioni del tasso di secrezione della saliva intera non stimolata nella cavità orale sono probabilmente il parametro più importante per lo sviluppo biologico della xerostomia e delle condizioni patologiche del cavo orale che l'accompagnano. Tutta la saliva, ad esempio le secrezioni miste delle ghiandole salivari maggiori e minori, viene mescolata nella cavità orale. Una corretta determinazione di questo valore è fondamentale per la valutazione dell'esito del trattamento in questo progetto. Per la valutazione del flusso di saliva, la saliva intera sarà raccolta tra le 9 e le 12:00. I soggetti si asterranno dal mangiare, bere, fumare e dall'igiene orale per 2 ore prima della raccolta. Dopo essere stati seduti in posizione eretta su una sedia, si rilassano per 5 minuti e vengono quindi istruiti a fare il minor numero di movimenti possibile, inclusa la deglutizione, durante la raccolta.

Prima e dopo il trattamento la saliva intera non stimolata verrà raccolta utilizzando il metodo dello sputo [33] in cui i partecipanti sputano la loro saliva in un contenitore di raccolta per un periodo di 15 minuti. La portata salivare (SFR) (ml/min) è determinata come l'aumento di peso del contenitore diviso per il tempo di raccolta in minuti.

Dopo la raccolta della saliva non stimolata, ai soggetti viene chiesto di masticare 1 g di paraffina sterile. Verrà chiesto loro di tenere la bocca chiusa durante la masticazione e di evitare di deglutire. Ogni 60 secondi verrà chiesto loro di sputare in un nuovo collettore di saliva prima di iniziare un nuovo periodo di masticazione. Questo sarà ripetuto per 5 min.

Per valutare l'esito del trattamento delle ghiandole sottomandibolari, la saliva viene anche raccolta direttamente dal pavimento della bocca in uno stato non stimolato e stimolato. La velocità del flusso di saliva totale non stimolata delle ghiandole sottomandibolari sarà valutata con il metodo del tampone con rulli di cotone posizionati buccalmente in ciascuna regione molare mascellare e sotto la lingua sul pavimento della bocca. Immediatamente prima dell'inizio della raccolta verrà chiesto loro di deglutire, nel caso ciò non fosse possibile verrà estratta la saliva con una pipetta. La raccolta avviene durante due periodi successivi di 3 minuti e, alla fine di ogni periodo, il mento e le labbra verranno asciugati con un tovagliolo. I flussi di saliva sono determinati in peso (1 g equivale a 1 ml di saliva) con rotoli e tovaglioli pesati prima della raccolta e ripesati dopo. La portata è calcolata come incremento in peso durante la raccolta ed espressa in millilitri al minuto. La saliva dei rulli di cotone sarà estratta per centrifugazione (1500g) e analizzata per la sua composizione. Questo processo di raccolta stimolato verrà eseguito successivamente con rulli contenenti agrumi per stimolare al massimo le ghiandole sottomandibolari. Da ciascuna di queste raccolte di saliva, la saliva sarà aliquotata e conservata a -80°C.

Analisi chimica della saliva Tutta la saliva contiene un gran numero di batteri e cellule epiteliali, oltre al liquido crevicolare gengivale. Pertanto, la saliva intera normalmente non è adatta per l'analisi di parametri chimici sensibili. A tale scopo, la saliva raccolta selettivamente dalle singole ghiandole è molto migliore. Di conseguenza, la maggior parte delle analisi può essere eseguita dalla saliva della ghiandola parotide e sottomandibolare/sublinguale. Sulla saliva raccolta verranno eseguite le seguenti analisi: pH e bicarbonato mediante stima del bilancio ionico [34], sodio, potassio, calcio, fosfato, cloruro e fluoruro [35], proteine ​​totali e proteine ​​selezionate [36] e amilasi [37] . Lo scopo degli studi è valutare se la saliva sarà normalizzata dopo il trattamento, e quindi fornire una stima della capacità protettiva della saliva dentale e della mucosa prima e dopo il trattamento.

Raccolta e analisi dei dati Dati di origine: ci sarà la documentazione di origine per tutti i dati in Case Report Form (CRF).

Il direttore dello studio consente l'accesso diretto ai dati e ai documenti dello studio per il monitoraggio, l'audit e l'ispezione del comitato etico scientifico, dell'autorità danese per la salute e i medicinali o autorità simili in altri paesi. Sarà richiesta l'autorizzazione al DPA per il trattamento dei dati personali ai sensi della legge danese sulla protezione dei dati. Le domande saranno inviate tramite la segreteria legale, Rigshospitalet.