Células madre mesenquimales para la xerostomía inducida por radiación (MESRIX)

Diseño Ensayo controlado aleatorizado con cegamiento. Para mantener el ocultamiento de la asignación, todos los participantes, cuidadores, investigadores de ensayos y evaluadores de resultados, excepto el personal del banco de sangre, estarán cegados a la intervención. El personal del Banco de Sangre no tendrá contacto directo con los pacientes (en adelante los participantes) como tal.

Plan del proyecto Para su inclusión en el estudio, a los participantes se les tomará su historial médico habitual de acuerdo con las directrices del Departamento de Cirugía de Oído, Nariz y Garganta del Hospital Universitario Rigshospitalet de Copenhague.

Todos los participantes se someterán a una minisucción de labios, a partir de la cual los MSC se expandirán ex vivo en una instalación de sala limpia aprobada por buenas prácticas de fabricación (GMP, por sus siglas en inglés) (The Blood Bank, sección 2014). Cuando las células lleguen al Banco de Sangre, los participantes serán asignados aleatoriamente a la expansión ex vivo de sus células madre mesenquimales o congeladas para un posible uso posterior. La fase de expansión ex vivo esperada es de 3-4 semanas. La purificación y el aislamiento se basarán en un protocolo previamente aprobado para uso clínico.

Cantidad de MSC requerida para la inyección Según los estudios publicados en animales, la cantidad administrada para la xerostomía en ratones varía de 2 x 105 a 2 x 106 [19]. Para convertir estos datos de ratones a una dosis realista en humanos, hemos extrapolado en base a los siguientes datos: La densidad de volumen de las glándulas submandibulares se aproxima mucho a 1 (1.06-1.07 mg/mm3) [27]. En los estudios de radioterapia con ratones, el peso medio de la glándula fue de aproximadamente 350 mg, lo que corresponde a un volumen aproximado de 350 mm3. Por lo tanto, la dosis de ratón pr. el volumen de la glándula es de aproximadamente 286.000-2.860.000 células pr. glándula cm3 (cuando se calcula de 1 x 105 a 1 x 106). El volumen de la glándula submandibular en sujetos humanos después de la radioterapia es de 6,6 a 7,9 cm3 [28]. Esto corresponde a una dosis aproximada pr. paciente de entre 1,9 x 106 a 2,2 x 106, o 1,9 x 107 a 2,2 x 107 células pr. glándula submandibular. A partir de los supuestos anteriores y para no dar a pocas células hemos optado por proceder con la dosis máxima correspondiente a 2,8*10^6 MSC/cm^3 glándula, es decir una dosis total máxima por paciente de aproximadamente 4,6*10 ^ 7 MSC. Sin embargo, para estandarizar la dosis administrada a los pacientes, la cantidad administrada se estandarizará al tamaño de sus glándulas submandibulares, como se describe a continuación.

Inyección de MSC en glándulas submandibulares Los sujetos irán al departamento de otorrinolaringología, sección 2073 para procedimientos de hospitalización. El procedimiento quirúrgico se realiza bajo anestesia local mediante guía ultrasónica y técnica estéril. Después de recibir la suspensión de MSC o la suspensión de placebo, el cirujano identificará las glándulas submandibulares e inyectará las MSC en suspensión. Cálculo del número inyectado de MSC pr. participante se basa en el siguiente cálculo: , donde el volumen es el volumen de la glándula submandibular, y un volumen de la glándula de app. 7-8cm3 es la norma. Por lo tanto la cantidad de celdas entregadas a cada participante será app. en total. Posteriormente, al participante se le dará una tirita y analgésicos de venta libre. Las MSC se suspenderán en NaCl Isotónico (0,9 mg/ml) y Albúmina Humana (HA) al 1% hasta un volumen final de 2ml. El placebo será 2ml de NaCl Isotónico (0,9mg/ml) y HA 1%.

La resonancia magnética de seguimiento del lugar del receptor se realizará después de 3-4 semanas y 3-4 meses después de la operación. La resonancia magnética se utiliza para la determinación del volumen de las glándulas salivales y el control del lugar del receptor.

Después de 3-4 meses, se toma aleatoriamente una pequeña biopsia de una de las dos glándulas salivales. El procedimiento se realiza bajo anestesia local. Se determina la histología (las muestras están cegadas al patólogo).

Cuando se haya realizado la resonancia magnética final, la biopsia y la prueba de función salival aprox. 3-4 meses después del tratamiento, se concluyen las pruebas y actividades relacionadas con el estudio específico. Para detectar complicaciones tardías o eventos adversos tardíos, todos los participantes del estudio que recibieron tratamiento con MSC están invitados a un chequeo 1 año y 3 años después del tratamiento.

Seguridad, aislamiento y propagación de MSC El Banco de Sangre tiene su aprobación de tejido celular de la Autoridad Danesa de Salud y Medicamentos (de acuerdo con la Ley Danesa de Tejidos), así como una Autorización de Fabricante/Importador con respecto a Medicamentos Humanos, las instalaciones físicas necesarias, personal y recursos operativos para producir MSC de acuerdo con las buenas prácticas de fabricación (GMP).

El producto MSC se analizará en busca de marcadores de superficie reconocidos (CD73, CD90, CD105) mediante citometría de flujo y se someterá a controles de calidad generales antes de la liberación final (viabilidad celular y pruebas de microorganismos). Con respecto al cultivo de las MSC, utilizaremos un medio basal suplementado con lisado de plaquetas humanas de donantes de sangre sanos en lugar del uso anterior de suero derivado de animales (suero bovino fetal, FBS). Esto tiene los siguientes beneficios: 1) No hay probabilidad de transfección de patógenos animales conocidos y desconocidos, o riesgo de xenoinmunización 2) Pequeña variación de lote a lote y, por lo tanto, un rendimiento de crecimiento más consistente, ya que cada grupo se prepara a partir de aprox. 50 donantes sanos.

Toda la cosecha, aislamiento, expansión, etc. de MSC se realizará de acuerdo con las normas GMP. El banco de sangre cuenta con instalaciones de salas limpias aprobadas por la Autoridad danesa de salud y medicamentos para la expansión celular compatible con GMP para uso clínico, y todos los estudios serán realizados por personal especialmente capacitado.

Evaluación de la xerostomía y resultado subjetivo del tratamiento El efecto subjetivo del tratamiento se evalúa mediante una escala analógica visual de xerostomía de 100 mm completada por el paciente [31] y un cuestionario calificado por el médico [32], ambos realizados antes y después tratamiento. A cada participante también se le preguntará sobre los síntomas diarios de boca seca de acuerdo con el punto 3.3 de la escala de calificación de efectos secundarios de la UKU [29]. Esta escala incluye cuatro puntajes donde 0 indica que no hay sensación de sequedad en la boca, 1 indica una leve sensación de sequedad en la boca, 2 indica una sensación intensa de sequedad en la boca y 3 indica una sensación molesta de sequedad en la boca que dificulta el habla y la alimentación.

Evaluación de la tasa de flujo salival y el resultado objetivo del tratamiento Los cambios en la tasa de secreción de la saliva entera no estimulada en la cavidad oral es probablemente el parámetro más importante para el desarrollo biológico de la xerostomía y las condiciones patológicas orales que la acompañan. La saliva entera, por ejemplo, las secreciones mixtas de las glándulas salivales mayores y menores se mezclan en la cavidad oral. Una determinación correcta de este valor es crucial para la evaluación del resultado del tratamiento en este proyecto. Para la evaluación de la tasa de flujo de saliva, se recolectará saliva entera entre las 9 y las 12 a.m. Los sujetos se abstendrán de comer, beber, fumar y de la higiene bucal durante 2 horas antes de la recolección. Después de estar sentados en posición vertical en una silla, se relajan durante 5 minutos y luego se les indica que realicen la menor cantidad de movimientos posible, incluida la deglución, durante la recolección.

Antes y después del tratamiento, la saliva entera no estimulada se recogerá utilizando el método de escupir [33], en el que los participantes escupen su saliva en un recipiente de recogida durante un período de 15 minutos. La tasa de flujo salival (SFR) (ml/min) se determina como el aumento de peso del recipiente dividido por el tiempo de recolección en minutos.

Después de la recolección de saliva no estimulada, se instruye a los sujetos para que mastiquen 1 g de cera de parafina estéril. Se les pedirá que mantengan la boca cerrada durante la masticación y que eviten tragar. Cada 60 segundos se les pedirá que escupan en un nuevo colector de saliva antes de comenzar un nuevo período de masticación. Esto se repetirá durante 5 min.

Para evaluar el resultado del tratamiento de las glándulas submandibulares, también se recolecta saliva directamente del piso de la boca en un estado estimulado y sin estimular. La tasa de flujo de saliva total no estimulada de las glándulas submandibulares se evaluará mediante el método de hisopado con rollos de algodón colocados bucalmente en cada región molar superior y debajo de la lengua en el piso de la boca. Inmediatamente antes del inicio de la recolección se les pedirá que traguen, en caso de que esto no sea posible se les extraerá la saliva con una pipeta. La recogida se realiza durante dos periodos sucesivos de 3 min y, al final de cada periodo, se limpiará la barbilla y los labios con una servilleta. Las tasas de flujo de saliva se determinan por peso (1 g equivale a 1 ml de saliva) con rollos y servilletas que se pesan antes de la recolección y se vuelven a pesar después. Los caudales se calculan como el incremento de peso durante la recolección y se expresan en mililitros por minuto. La saliva de los rollos de algodón se extraerá por centrifugación (1500 g) y se analizará para conocer su composición. Este proceso de recolección estimulada se realizará posteriormente con rollos que contienen cítricos para estimular al máximo las glándulas submandibulares. De cada una de estas colecciones de saliva, la saliva se dividirá en alícuotas y se almacenará a -800C.

Análisis químico de la saliva La saliva entera contiene un gran número de bacterias y células epiteliales, así como líquido crevicular gingival. Por lo tanto, la saliva entera normalmente no es adecuada para el análisis de parámetros químicos sensibles. Para este propósito, la saliva recolectada selectivamente de las glándulas individuales es mucho mejor. Como resultado, la mayoría de los análisis se pueden realizar a partir de la glándula parótida y submandibular/sublingualis saliva. A la saliva recolectada se le realizarán los siguientes análisis: pH y bicarbonato por estimación del balance iónico [34], sodio, potasio, calcio, fosfato, cloruro y flúor [35], proteína total y proteínas seleccionadas [36] y amilasa [37] . El propósito de los estudios es evaluar si la saliva se normalizará después del tratamiento y, por lo tanto, proporcionar una estimación de la capacidad protectora de la saliva dental y de la mucosa antes y después del tratamiento.

Recopilación y análisis de datos Fuente de datos: Habrá documentación fuente para todos los datos en el Formulario de informe de caso (CRF).

El director del estudio permite el acceso directo a los datos y documentos del estudio para el seguimiento, la auditoría y la inspección del Comité de Ética Científica, la Autoridad Danesa de Salud y Medicamentos o autoridades similares en otros países. Se solicitará el permiso de la DPA para el procesamiento de datos personales en virtud de la Ley danesa de protección de datos. Las solicitudes se enviarán a través de la secretaría jurídica, Rigshospitalet.