Mesenchymale stamcellen voor door straling geïnduceerde xerostomie (MESRIX)

Opzet Gerandomiseerde, gecontroleerde trial met blindering. Om de toewijzing geheim te houden, zullen alle deelnemers, zorgverleners, onderzoeksonderzoekers en uitkomstbeoordelaars, behalve het personeel van de Bloedbank, blind zijn voor de interventie. Medewerkers van de Bloedbank zullen als zodanig geen direct contact hebben met de patiënten (hierna de deelnemers).

Projectplan Voor opname in het onderzoek zullen de deelnemers hun gebruikelijke medische anamnese laten afnemen volgens de richtlijnen van de Keel-, Neus- en Keelchirurgische afdeling van het Universitair Ziekenhuis van Kopenhagen, Rigshospitalet.

Alle deelnemers ondergaan een mini-lip-uitzuiging, van waaruit MSC's ex vivo worden uitgebreid in een door GMP goedgekeurde cleanroom-faciliteit (The Blood Bank, sectie 2014). Wanneer de cellen bij de bloedbank aankomen, worden de deelnemers gerandomiseerd naar ofwel ex vivo expansie van hun mesenchymale stamcellen of ze laten invriezen voor mogelijk later gebruik. De verwachte ex vivo expansiefase is 3-4 weken. De zuivering en isolatie zullen gebaseerd zijn op een protocol dat eerder is goedgekeurd voor klinisch gebruik.

Aantal benodigde MSC's voor injectie Op basis van gepubliceerde dierstudies varieert de hoeveelheid die voor xerostomie aan muizen wordt gegeven van 2 x 105 tot 2 x 106 [19]. Om deze muizengegevens om te zetten in een realistische dosis bij mensen hebben we geëxtrapoleerd op basis van de volgende gegevens: De volumedichtheid van submandibulaire klieren benadert zeer dicht 1 (1,06-1,07 mg/mm3) [27]. In de muizenstudies over radiotherapie was het gemiddelde kliergewicht ongeveer 350 mg, wat overeenkomt met een volume van ongeveer 350 mm3. Daarom is de muisdosis pr. kliervolume is ongeveer 286.000-2.860.000 cellen pr. cm3 wartel (indien berekend van 1 x 105 tot 1 x 106). Het volume van de submandibulaire klier bij mensen na radiotherapie is 6,6-7,9 cm3 [28]. Dit komt overeen met een geschatte dosis pr. patiënt van tussen 1,9 x 106 tot 2,2 x 106, of 1,9 x 107 tot 2,2 x 107 cellen pr. submandibulaire klier. Op basis van bovenstaande aannames en om niet aan weinig cellen te geven, hebben we ervoor gekozen om door te gaan met de maximale dosis die overeenkomt met 2,8 * 10 ^ 6 MSC / cm ^ 3 klier, d.w.z. een maximale totale dosis per patiënt van ongeveer 4,6 * 10 ^ 7 MSC's. Om de aan patiënten gegeven dosis te standaardiseren, wordt de toegediende hoeveelheid echter gestandaardiseerd naar de grootte van hun submandibulaire klieren, zoals hieronder beschreven.

Injectie van MSC's in submandibulaire klieren Proefpersonen gaan naar de KNO-afdeling, sectie 2073 voor intramurale procedures. De chirurgische procedure wordt uitgevoerd onder plaatselijke verdoving met behulp van ultrasone begeleiding en steriele techniek. Na ontvangst van de MSC-suspensie of placebo-suspensie zal de chirurg de submandibulaire klieren identificeren en de suspensie-MSC's injecteren. Berekening geïnjecteerd aantal MSC's pr. deelnemer gaat uit van de volgende berekening: , waarbij volume het volume is van de submandibulaire klier, en een kliervolume van app. 7-8cm3 is de norm. Daarom zal het aantal cellen dat aan elke deelnemer wordt gegeven, app zijn. in totaal. Daarna krijgt de deelnemer een pleister en vrij verkrijgbare analgetica. De MSC's worden gesuspendeerd in isotoon NaCl (0,9 mg/ml) en humaan albumine (HA) 1% tot een eindvolume van 2 ml. Placebo is 2 ml isotoon NaCl (0,9 mg/ml) en HA 1%.

Na 3-4 weken en 3-4 maanden na de operatie wordt een follow-up-MRI van de plaats van de ontvanger uitgevoerd. MRI wordt gebruikt voor volumebepaling van speekselklieren en controle van de plaats van de ontvanger.

Na 3-4 maanden wordt willekeurig een kleine biopsie genomen van een van de twee speekselklieren. De ingreep vindt plaats onder plaatselijke verdoving. Histologie wordt bepaald (monsters zijn geblindeerd voor de patholoog).

Wanneer de definitieve MRI, biopsie en speekselfunctietest is uitgevoerd, ca. 3-4 maanden na de behandeling zijn specifieke studiegerelateerde testen en activiteiten afgerond. Om late complicaties of late bijwerkingen op te sporen, worden alle studiedeelnemers die een MSC-behandeling hebben ondergaan, 1 jaar en 3 jaar na de behandeling uitgenodigd voor een controle.

Veiligheid, isolatie en vermeerdering van MSC De Bloedbank heeft zijn goedkeuring voor celweefsel van de Deense gezondheids- en geneesmiddelenautoriteit (volgens de Deense weefselwet), evenals een autorisatie van de fabrikant/importeur met betrekking tot geneesmiddelen voor menselijk gebruik, de nodige fysieke faciliteiten, personeel en operationele middelen om MSC's te produceren in overeenstemming met goede fabricagepraktijken (GMP).

Het MSC-product wordt getest op erkende oppervlaktemarkers (CD73, CD90, CD105,) met behulp van flowcytometrie en ondergaat algemene kwaliteitscontroles voordat het uiteindelijk wordt vrijgegeven (levensvatbaarheid van de cellen en tests op micro-organismen). Voor de kweek van de MSC gaan we basaal medium gebruiken aangevuld met humaan bloedplaatjeslysaat van gezonde bloeddonoren in plaats van het vroegere gebruik van dierlijk serum (foetaal runderserum, FBS). Dit heeft de volgende voordelen: 1) Geen waarschijnlijkheid van transfectie van zowel bekende als onbekende dierpathogenen, of risico op xeno-immunisatie 2) Kleine batch-tot-batch variatie en dus meer consistente groeiprestaties, aangezien elke groep wordt bereid vanaf ongeveer. 50 gezonde donoren.

Alle oogst, isolatie, uitbreiding, enz. van MSC zal in overeenstemming zijn met de GMP-voorschriften. De Bloedbank beschikt over cleanroomfaciliteiten die zijn goedgekeurd door de Deense gezondheids- en geneesmiddelenautoriteit voor GMP-conforme celexpansie voor klinisch gebruik, en alle onderzoeken zullen worden uitgevoerd door speciaal opgeleid personeel.

Beoordeling van xerostomie en subjectief behandelresultaat Het subjectieve effect van de behandeling wordt beoordeeld door middel van een 100 mm visueel analoge schaal van xerostomie ingevuld door de patiënt [31] en een door een arts beoordeelde vragenlijst [32], zowel voor als na behandeling. Elke deelnemer zal ook worden gevraagd naar dagelijkse symptomen van een droge mond volgens de UKU-bijwerkingsbeoordelingsschaal item 3.3 [29]. Deze schaal omvat vier scores waarbij 0 staat voor geen gevoel van droge mond, 1 voor een licht gevoel van droge mond, 2 voor een ernstig gevoel van droge mond en 3 voor een lastig gevoel van droge mond dat spraak en eten moeilijk maakt.

Beoordeling van speekselstroomsnelheid en objectief behandelingsresultaat Veranderingen in de secretiesnelheid van het niet-gestimuleerde speeksel in de mondholte is waarschijnlijk de belangrijkste parameter voor de biologische ontwikkeling van xerostomie en bijbehorende pathologische orale aandoeningen. Heel speeksel, bijvoorbeeld de gemengde secreties van de grote en kleine speekselklieren, wordt gemengd in de mondholte. Een juiste bepaling van deze waarde is cruciaal voor de beoordeling van het behandelresultaat in dit project. Voor beoordeling van de speekselafvoer wordt tussen 9.00 en 12.00 uur heel speeksel afgenomen. Onderwerpen onthouden zich van eten, drinken, roken en mondhygiëne gedurende 2 uur vóór de verzameling. Nadat ze rechtop in een stoel zijn gaan zitten, ontspannen ze 5 minuten en krijgen ze de instructie om tijdens het verzamelen zo min mogelijk bewegingen te maken, inclusief slikken.

Voor en na de behandeling wordt ongestimuleerd volledig speeksel verzameld met behulp van de spuugmethode [33], waarbij deelnemers hun speeksel gedurende een periode van 15 minuten in een opvangbak spugen. De speekselstroomsnelheid (SFR) (ml/min) wordt bepaald als de gewichtstoename van de container gedeeld door de verzameltijd in minuten.

Na het verzamelen van ongestimuleerd speeksel krijgen de proefpersonen de instructie om op 1 g steriele paraffinewas te kauwen. Ze zullen worden gevraagd om hun mond gesloten te houden tijdens het kauwen en om slikken te voorkomen. Elke 60 seconden wordt hen gevraagd om in een nieuwe speekselverzamelaar te spugen voordat ze aan een nieuwe kauwperiode beginnen. Dit wordt gedurende 5 minuten herhaald.

Om het behandelingsresultaat van de submandibulaire klieren te beoordelen, wordt speeksel ook rechtstreeks van de mondbodem verzameld in een niet-gestimuleerde en gestimuleerde toestand. De ongestimuleerde speekselstroom van de submandibulaire klieren wordt beoordeeld met behulp van een wattenstaafje met wattenrollen die buccaal in elk gebied van de bovenkaak en onder de tong op de mondbodem worden geplaatst. Direct voor aanvang van de afname wordt gevraagd te slikken, indien dit niet mogelijk is wordt er met een pipet speeksel afgenomen. Het verzamelen vindt plaats gedurende twee opeenvolgende perioden van 3 minuten en aan het einde van elke periode worden de kin en lippen afgeveegd met een servet. Speekselstroomsnelheden worden bepaald op basis van gewicht (1 g is gelijk aan 1 ml speeksel) waarbij rollen en servetten worden gewogen vóór verzameling en daarna opnieuw worden gewogen. De stroomsnelheden worden berekend als de gewichtstoename tijdens het verzamelen en uitgedrukt in milliliter per minuut. Het speeksel van de wattenrollen wordt middels centrifugatie (1500g) geëxtraheerd en geanalyseerd op samenstelling. Dit gestimuleerde verzamelproces wordt daarna uitgevoerd met citrushoudende rollen om de submandibulaire klieren maximaal te stimuleren. Van elk van deze verzamelingen speeksel wordt speeksel in porties verdeeld en bewaard bij -80°C.

Chemische analyse van speeksel Heel speeksel bevat een groot aantal bacteriën en epitheelcellen, evenals tandvleesvocht. Daarom is heel speeksel normaal gesproken niet geschikt voor de analyse van gevoelige chemische parameters. Voor dit doel is het selectief verzamelde speeksel van individuele klieren veel beter. Als gevolg hiervan kunnen de meeste analyses worden uitgevoerd vanaf de oorspeekselklier en de submandibulaire klier / sublingualis speeksel. De volgende analyses worden uitgevoerd op het verzamelde speeksel: pH en bicarbonaat door schatting van de ionische balans [34], natrium, kalium, calcium, fosfaat, chloride en fluoride [35], totaal eiwit en geselecteerde eiwitten [36] en amylase [37] . Het doel van de onderzoeken is om te evalueren of het speeksel na de behandeling genormaliseerd zal zijn, en zo een schatting te geven van de tand- en slijmvliesbeschermende capaciteit van speeksel voor en na de behandeling.

Gegevensverzameling en -analyse Brongegevens: Er zal brondocumentatie zijn voor alle gegevens in Case Report Form (CRF).

De onderzoeksleider geeft directe toegang tot onderzoeksgegevens en onderzoeksdocumenten voor de monitoring, audit en inspectie van de Wetenschapsethische Commissie, de Deense Gezondheids- en Geneesmiddelenautoriteit of soortgelijke autoriteiten in andere landen. Er zal toestemming worden gevraagd aan de gegevensbeschermingsautoriteit voor de verwerking van persoonsgegevens onder de Deense wet op de gegevensbescherming. Aanvragen worden verzonden via het wettelijk secretariaat, Rigshospitalet.