Мезенхимальные стволовые клетки при радиационно-индуцированной ксеростомии (MESRIX)

Дизайн Рандомизированное контролируемое исследование со слепым методом. Для обеспечения сокрытия распределения все участники, лица, осуществляющие уход, исследователи и оценщики результатов, за исключением сотрудников банка крови, не будут знать о вмешательстве. Персонал банка крови не будет иметь прямого контакта с пациентами (далее участники) как таковые.

План проекта Для включения в исследование у участников будет собрана их обычная история болезни в соответствии с рекомендациями отделения хирургии уха, горла и носа Копенгагенской университетской больницы Rigshospitalet.

Все участники пройдут мини-отсасывание губ, после чего МСК будут экс-виво размножены в чистых помещениях, одобренных надлежащей производственной практикой (GMP) (Банк крови, раздел 2014 г.). Когда клетки поступят в банк крови, участников рандомизируют либо для расширения их мезенхимальных стволовых клеток ex vivo, либо для их замораживания для возможного последующего использования. Ожидаемая фаза расширения ex vivo составляет 3-4 недели. Очистка и выделение будут основаны на протоколе, ранее одобренном для клинического использования.

Количество МСК, необходимое для инъекции На основании опубликованных исследований на животных количество, назначаемое мышам при ксеростомии, варьируется от 2 х 105 до 2 х 106 [19]. Чтобы преобразовать эти данные на мышах в реальную дозу для человека, мы экстраполировали на основе следующих данных: мг/мм3) [27]. В исследованиях лучевой терапии на мышах средний вес железы составлял примерно 350 мг, что соответствует приблизительному объему 350 мм3. Следовательно, доза мыши pr. объем железы составляет примерно 286 000-2 860 000 клеток пр. см3 железы (при расчете от 1 х 105 до 1 х 106). Объем поднижнечелюстной железы у человека после лучевой терапии составляет 6,6-7,9 см3. [28]. Это соответствует примерной дозе pr. у пациента от 1,9 х 106 до 2,2 х 106 или от 1,9 х 107 до 2,2 х 107 клеток pr. поднижнечелюстная железа. Исходя из вышеизложенных предположений и для того, чтобы не давать несколько клеток, мы выбрали максимальную дозу, соответствующую 2,8*10^6 МСК/см^3 железы, т.е. максимальную общую дозу на пациента примерно 4,6*10 ^7 МСК. Однако для стандартизации доз, вводимых пациентам, вводимое количество будет стандартизировано в соответствии с размером их поднижнечелюстных желез, как описано ниже.

Введение МСК в поднижнечелюстные железы Субъекты направляются в ЛОР-отделение, отделение 2073, для стационарных процедур. Хирургическая процедура проводится под местной анестезией с использованием ультразвукового контроля и стерильной техники. После получения суспензии МСК или суспензии плацебо хирург идентифицирует поднижнечелюстные железы и вводит суспензию МСК. Расчет введенного количества МСК пр. Участник опирается на следующий расчет: , где объем - объем поднижнечелюстной железы, а железы - объем ок. 7-8см3 это норма. Поэтому количество ячеек, выдаваемых каждому участнику, будет ок. в итоге. После этого участнику будет выдан пластырь и безрецептурные анальгетики. МСК суспендируют в изотоническом растворе NaCl (0,9 мг/мл) и человеческом альбумине (HA) 1% до конечного объема 2 мл. Плацебо будет состоять из 2 мл изотонического раствора NaCl (0,9 мг/мл) и 1% ГК.

Контрольная МРТ реципиентного места проводится через 3-4 недели и 3-4 месяца после операции. МРТ используется для определения объема слюнных желез и контроля реципиентного места.

Через 3-4 месяца произвольно берут небольшую биопсию из одной из двух слюнных желез. Процедура проходит под местной анестезией. Определяется гистология (образцы слепы для патологоанатома).

Когда окончательное МРТ, биопсия и тест функции слюны были выполнены прибл. Через 3-4 месяца после лечения завершаются анализы и мероприятия, связанные с исследованием. Для выявления поздних осложнений или поздних нежелательных явлений все участники исследования, получавшие лечение МСК, приглашаются на контрольный осмотр через 1 год и 3 года после лечения.

Безопасность, изоляция и размножение МСК. Банк крови имеет одобрение для клеток и тканей от Датского управления здравоохранения и лекарственных средств (в соответствии с Законом Дании о тканях), а также разрешение производителя/импортера лекарственных препаратов для человека, необходимые физические помещения, персонал и операционные ресурсы для производства МСК в соответствии с надлежащей производственной практикой (GMP).

Продукт МСК будет протестирован на наличие признанных поверхностных маркеров (CD73, CD90, CD105) с использованием проточной цитометрии и пройдет общую проверку качества перед окончательным выпуском (жизнеспособность клеток и тесты на микроорганизмы). Что касается культивирования MSC, мы будем использовать базальную среду, дополненную лизатом тромбоцитов человека от здоровых доноров крови, вместо прежнего использования сыворотки животного происхождения (эмбриональной бычьей сыворотки, FBS). Это имеет следующие преимущества: 1) Отсутствие вероятности трансфекции как известных, так и неизвестных животных патогенов или риска ксеноиммунизации 50 здоровых доноров.

Весь сбор, изоляция, расширение и т. д. MSC будут осуществляться в соответствии с правилами GMP. Банк крови располагает чистыми помещениями, одобренными Датским управлением по здравоохранению и лекарственным средствам для размножения клеток в соответствии с требованиями GMP для клинического использования, и все исследования будут проводиться специально обученным персоналом.

Оценка ксеростомии и субъективный результат лечения Субъективный эффект лечения оценивают по 100-миллиметровой визуально-аналоговой шкале ксеростомии, заполняемой пациентом [31], и опроснику, оцениваемому врачом [32], как до, так и после лечения. лечение. Каждому участнику также будет задан вопрос о ежедневных симптомах сухости во рту в соответствии с пунктом 3.3 шкалы оценки побочных эффектов UKU [29]. Эта шкала включает четыре балла, где 0 означает отсутствие ощущения сухости во рту, 1 означает легкое ощущение сухости во рту, 2 означает сильное ощущение сухости во рту и 3 означает неприятное ощущение сухости во рту, которое затрудняет речь и прием пищи.

Оценка скорости слюноотделения и объективных результатов лечения Изменение скорости секреции нестимулированной цельной слюны в полости рта, вероятно, является важнейшим параметром биологического развития ксеростомии и сопутствующих ей патологических состояний полости рта. Вся слюна, например, смешанные выделения больших и малых слюнных желез, смешивается в полости рта. Правильное определение этого значения имеет решающее значение для оценки результатов лечения в этом проекте. Для оценки скорости слюноотделения всю слюну собирают между 9 и 12 часами утра. Субъекты будут воздерживаться от еды, питья, курения и гигиены полости рта в течение 2 часов до сбора. После того, как они сидят прямо на стуле, они расслабляются в течение 5 минут, а затем их просят делать как можно меньше движений, включая глотание, во время сбора.

До и после лечения нестимулированная цельная слюна будет собираться с использованием метода выплевывания [33], когда участники выплевывают свою слюну в контейнер для сбора в течение 15 минут. Скорость слюноотделения (ССР) (мл/мин) определяют как увеличение массы контейнера, деленное на время сбора в минутах.

После сбора нестимулированной слюны испытуемых просят жевать 1 г стерильного парафина. Их попросят держать рот закрытым во время жевания и избегать глотания. Каждые 60 секунд их будут просить сплюнуть в новый сборник слюны перед началом нового периода жевания. Это будет повторяться в течение 5 мин.

Для оценки результатов лечения поднижнечелюстных желез также собирают слюну непосредственно со дна полости рта в нестимулированном и стимулированном состоянии. Нестимулированный общий поток слюны из поднижнечелюстных желез будет оцениваться методом мазка с ватными валиками, размещенными щечно в области каждого верхнечелюстного моляра и под языком на дне рта. Непосредственно перед началом сбора их попросят проглотить, если это невозможно, слюна будет извлечена пипеткой. Сбор проводится в течение двух последовательных периодов по 3 мин, и в конце каждого периода подбородок и губы вытираются салфеткой. Скорость потока слюны определяют по весу (1 г равен 1 мл слюны) с помощью рулонов и салфеток, взвешенных перед сбором и повторно взвешенных после. Скорость потока рассчитывается как приращение веса во время сбора и выражается в миллилитрах в минуту. Слюна из ватных валиков будет извлечена путем центрифугирования (1500 г) и проанализирована на ее состав. Этот стимулированный процесс сбора будет выполняться впоследствии с помощью цитрусовых булочек, чтобы максимально стимулировать поднижнечелюстные железы. Из каждой из этих коллекций слюны берут на аликвоты и хранят при температуре -80°С.

Химический анализ слюны Вся слюна содержит большое количество бактерий и эпителиальных клеток, а также жидкость десневой борозды. Таким образом, цельная слюна обычно не подходит для анализа чувствительных химических параметров. Для этой цели гораздо лучше подходит выборочно собранная слюна из отдельных желез. В результате большинство анализов можно проводить либо из околоушной, либо из поднижнечелюстной железы/подъязычной слюны. В собранной слюне будут проведены следующие анализы: рН и бикарбонаты путем оценки ионного баланса [34], натрия, калия, кальция, фосфатов, хлоридов и фторидов [35], общего белка и отдельных белков [36] и амилазы [37]. . Целью исследований является оценка того, нормализуется ли слюноотделение после лечения, и, таким образом, оценка защитной способности слюны зубов и слизистых оболочек до и после лечения.

Сбор и анализ данных Исходные данные: исходная документация для всех данных будет представлена ​​в форме отчета о болезни (CRF).

Руководитель исследования разрешает прямой доступ к данным исследования и документам исследования для мониторинга, аудита и инспекции Комитета по этике науки, Датского управления здравоохранения и лекарственных средств или аналогичных органов в других странах. Разрешение будет запрашиваться у DPA для обработки персональных данных в соответствии с датским Законом о защите данных. Заявки будут отправлены через юридический секретариат Rigshospitalet.