Mezenchymální kmenové buňky pro radiačně indukovanou xerostomii (MESRIX)

Design Randomizovaný, kontrolovaný pokus se zaslepením. Aby bylo zachováno utajení přidělování, všichni účastníci, poskytovatelé péče, zkoušející a hodnotitelé výsledků kromě zaměstnanců Krevní banky budou vůči intervenci zaslepeni. Personál Krevní banky nebude mít přímý kontakt s pacienty (dále jen účastníky) jako takovými.

Plán projektu Pro zařazení do studie bude účastníkům odebrána jejich obvyklá anamnéza podle pokynů z chirurgického oddělení ušní, nosní a krční chirurgie, Kodaňská univerzitní nemocnice Rigshospitalet.

Všichni účastníci podstoupí mini odsávání rtů, ze kterého budou MSC ex vivo rozšířeny v zařízení pro čisté prostory schválené správnou výrobní praxí (GMP) (The Blood Bank, sekce 2014). Když buňky dorazí do krevní banky, budou účastníci randomizováni buď k ex vivo expanzi svých mezenchymálních kmenových buněk, nebo k jejich zmrazení pro případné pozdější použití. Očekávaná ex vivo expanzní fáze je 3-4 týdny. Purifikace a izolace budou založeny na protokolu dříve schváleném pro klinické použití.

Množství MSC potřebné pro injekci Na základě publikovaných studií na zvířatech se množství podávané pro xerostomii myším pohybuje od 2 x 105 do 2 x 106 [19]. Abychom převedli tyto údaje o myších na realistickou dávku u lidí, provedli jsme extrapolaci na základě následujících údajů: Objemová hustota submandibulárních žláz se velmi těsně blíží 1 (1,06-1,07 mg/mm3) [27]. Ve studiích radioterapie na myších byla průměrná hmotnost žlázy přibližně 350 mg, což odpovídá přibližnému objemu 350 mm3. Proto myš dávka pr. objem žlázy je přibližně 286 000-2 860 000 buněk pr. cm3 ucpávky (při výpočtu od 1 x 105 do 1 x 106). Objem submandibulární žlázy u lidí po radioterapii je 6,6-7,9 cm3 [28]. To odpovídá přibližné dávce pr. pacient mezi 1,9 x 106 až 2,2 x 106 nebo 1,9 x 107 až 2,2 x 107 buněk pr. submandibulární žláza. Z výše uvedených předpokladů a abychom nedávali málo buněk, rozhodli jsme se postupovat s maximální dávkou odpovídající 2,8*10^6 MSC/cm^3 žlázy, tj. maximální celkovou dávkou na pacienta přibližně 4,6*10 ^7 MSC. Nicméně pro standardizaci dávky podávané pacientům bude podané množství standardizováno podle velikosti jejich submandibulárních žláz, jak je popsáno níže.

Injekce MSC do submandibulárních žláz Subjekty půjdou na oddělení ORL, sekce 2073 pro lůžkové procedury. Operace se provádí v lokální anestezii za použití ultrazvukového vedení a sterilní techniky. Po obdržení suspenze MSC nebo suspenze s placebem chirurg identifikuje submandibulární žlázy a vstříkne suspenzi MSC. Výpočet injektovaného počtu MSC pr. účastník spočívá na následujícím výpočtu: , kde objem je objem submandibulární žlázy a objem žlázy cca. 7-8 cm3 je norma. Množství buněk, které dostane každý účastník, bude tedy přibližně. dohromady. Poté bude účastníkovi podán náplast a volně prodejná analgetika. MSC budou suspendovány v izotonickém NaCl (0,9 mg/ml) a lidském albuminu (HA) 1 % na konečný objem 2 ml. Placebo budou 2 ml izotonického NaCl (0,9 mg/ml) a HA 1 %.

Kontrolní MRI místa příjemce bude provedena po 3-4 týdnech a 3-4 měsících po operaci. MRI se používá pro stanovení objemu slinných žláz a kontrolu místa příjemce.

Po 3-4 měsících se náhodně odebere malá biopsie z jedné ze dvou slinných žláz. Zákrok probíhá v lokální anestezii. Stanoví se histologie (vzorky jsou pro patologa zaslepeny).

Po provedení závěrečné MRI, biopsie a testu funkce slin cca. 3-4 měsíce po léčbě jsou ukončeny specifické testy a aktivity související se studií. K detekci pozdních komplikací nebo pozdních nežádoucích příhod jsou všichni účastníci studie, kteří podstoupili léčbu MSC, pozváni na kontrolu 1 rok a 3 roky po léčbě.

Bezpečnost, izolace a množení MSC Krevní banka má schválení pro buněčnou tkáň od dánského úřadu pro zdraví a léčiva (podle dánského zákona o tkáních), stejně jako povolení výrobce/dovozce týkající se humánních léčivých přípravků, nezbytná fyzická zařízení, personální a provozní zdroje k výrobě MSC v souladu se správnou výrobní praxí (GMP).

Produkt MSC bude testován na rozpoznané povrchové markery (CD73, CD90, CD105) pomocí průtokové cytometrie a před konečným uvolněním podstoupí obecné kontroly kvality (životaschopnost buněk a testy na mikroorganismy). S ohledem na kultivaci MSC použijeme bazální médium doplněné lyzátem lidských krevních destiček od zdravých dárců krve namísto dřívějšího použití zvířecího séra (fetální bovinní sérum, FBS). To má následující výhody: 1) Žádná pravděpodobnost transfekce jak známými, tak neznámými zvířecími patogeny nebo riziko xenoimunizace 2) Malá variace mezi šarží a tím konzistentnější růst, protože každá skupina je připravena z cca. 50 zdravých dárců.

Veškerá sklizeň, izolace, expanze atd. MSC bude v souladu s předpisy GMP. Krevní banka má zařízení pro čisté prostory schválené Dánským úřadem pro zdraví a léčiva pro expanzi buněk v souladu s GMP pro klinické použití a všechny studie budou prováděny speciálně vyškoleným personálem.

Hodnocení xerostomie a subjektivní výsledek léčby Subjektivní účinek léčby se hodnotí pomocí 100mm vizuální analogové škály xerostomie vyplněné pacientem [31] a lékařem hodnoceného dotazníku [32], a to jak před, tak po léčba. Každý účastník bude také dotázán na každodenní příznaky sucha v ústech podle bodu 3.3 stupnice hodnocení vedlejších účinků UKU [29]. Tato stupnice zahrnuje čtyři skóre, kde 0 znamená žádný pocit sucha v ústech, 1 znamená mírný pocit sucha v ústech, 2 znamená silný pocit sucha v ústech a 3 znamená nepříjemný pocit sucha v ústech, který ztěžuje řeč a příjem potravy.

Hodnocení rychlosti průtoku slin a objektivního výsledku léčby Změny v rychlosti sekrece nestimulovaných celých slin v dutině ústní jsou pravděpodobně nejdůležitějším parametrem pro biologický rozvoj xerostomie a doprovodných patologických stavů dutiny ústní. Celé sliny, např. smíšené sekrety z hlavních a vedlejších slinných žláz, se mísí v dutině ústní. Správné stanovení této hodnoty je klíčové pro hodnocení výsledku léčby v tomto projektu. Pro hodnocení rychlosti toku slin budou mezi 9 a 12 hodinou odebírány celé sliny. Subjekty se po dobu 2 hodin před odběrem zdrží jídla, pití, kouření a ústní hygieny. Po vzpřímeném usazení na židli se 5 minut uvolní a poté jsou instruováni, aby během odběru dělali co nejméně pohybů, včetně polykání.

Před a po ošetření budou nestimulované celé sliny odebrány metodou plivání [33], kdy účastníci plivají své sliny do sběrné nádobky po dobu 15 minut. Průtok slin (SFR) (ml/min) se stanoví jako přírůstek hmotnosti nádoby dělený dobou odběru v minutách.

Po odběru nestimulovaných slin jsou jedinci instruováni, aby žvýkali 1 g sterilního parafinového vosku. Budou požádáni, aby během žvýkání drželi ústa zavřená a nepolykali. Každých 60 sekund budou požádáni, aby plivli do nového sběrače slin před zahájením nového období žvýkání. Toto se bude opakovat po dobu 5 minut.

Pro posouzení výsledku léčby submandibulárních žláz se sliny také odebírají přímo ze dna úst v nestimulovaném a stimulovaném stavu. Nestimulovaný průtok celých slin submandibulárními žlázami bude hodnocen metodou stěru s bavlněnými smotky umístěnými bukálně v každé čelistní oblasti moláru a pod jazykem na dně úst. Bezprostředně před začátkem odběru budou požádáni, aby spolkli, v případě, že to není možné, budou sliny extrahovány pipetou. Odběr probíhá ve dvou po sobě jdoucích 3 minutách a na konci každé periody se brada a rty otřou ubrouskem. Rychlosti toku slin se stanoví hmotností (1 g se rovná 1 ml slin) s rolemi a ubrousky zváženými před odběrem a znovu zváženými po. Průtok se vypočítá jako přírůstek hmotnosti během odběru a vyjádří se v mililitrech za minutu. Sliny z bavlněných smotků budou extrahovány centrifugací (1500 g) a analyzovány na jejich složení. Tento stimulovaný proces odběru bude následně proveden s rolkami obsahujícími citrusy, aby se maximálně stimulovaly podčelistní žlázy. Z každého z těchto odběrů slin budou sliny rozděleny na alikvoty a skladovány při -80 °C.

Chemická analýza slin Celé sliny obsahují velké množství bakterií a epiteliálních buněk a také gingivální štěrbinovou tekutinu. Proto nejsou celé sliny obvykle vhodné pro analýzu citlivých chemických parametrů. Pro tento účel jsou mnohem lepší selektivně odebrané sliny z jednotlivých žláz. V důsledku toho lze většinu analýz provádět buď z příušní a podčelistní žlázy / ze slin sublingualis. Na odebraných slinách budou provedeny následující analýzy: pH a bikarbonát odhadem iontové bilance [34], sodík, draslík, vápník, fosfát, chlorid a fluor [35], celkový protein a vybrané proteiny [36] a amyláza [37] . Účelem studií je vyhodnotit, zda se sliny po léčbě normalizují, a poskytnout tak odhad ochranné kapacity zubů a sliznic slin před a po léčbě.

Sběr a analýza dat Zdrojová data: Ke všem datům bude k dispozici zdrojová dokumentace ve formuláři Case Report Form (CRF).

Vedoucí studie umožňuje přímý přístup ke studijním datům a studijním dokumentům pro monitorování, audit a inspekci Vědecké etické komise, Dánského úřadu pro zdraví a léčiva nebo podobných orgánů v jiných zemích. Ke zpracování osobních údajů bude podle dánského zákona o ochraně osobních údajů požadováno povolení od DPA. Přihlášky budou zaslány prostřednictvím právního sekretariátu Rigshospitalet.