Amyotrofinen lateraaliskleroosi ja synnynnäinen immuunijärjestelmä

Amyotrofinen lateraaliskleroosi (ALS) on etenevä, tappava, hermostoa rappeuttava sairaus, joka vaikuttaa ylempään ja alempaan motorisiin hermosoluihin. Tämä johtaa syvään lihasdystrofiaan, hyperrefleksiaan, bulbaarien ja luuston lihasten sidekudoksiin ja pareesiin. ALS aiheuttaa lisääntyvää fyysistä väsymystä ja potilaat joutuvat pian sänkyyn ja hengityksen vajaatoimintaan. ALS-diagnoosi tehdään El Escorialin revisitedin mukaan. Usein kliiniset ja neurofysiologiset testit on toistettava (1-4).

Tanskassa ALS:n ilmaantuvuus on 1-2/100 000 ja esiintyvyys on 4-6/100 000. Keskimääräinen eloonjäämisaika diagnoosista on 3 vuotta, mutta suurella vaihtelulla. (5+6)

Nykyään patogeneesi on edelleen tuntematon, eikä mikään hoito voi pysäyttää ALS:n etenemistä. Rilutsolihoito näyttää pidentävän keskimääräistä eloonjäämisaikaa 2 tai 3 kuukaudella (7).

Todennäköisesti tuleva lääkehoito vaatii parempaa ymmärtämistä ALS:n patogeneesistä ja patofysiologiasta. Tämä esillä oleva tutkimus pyrkii tekemään niin hypoteesin perusteella, että ALS johtuu osittain tai kokonaan komplementin aktivaatiosta.

Komplementtijärjestelmä on monimutkainen järjestelmä, joka koostuu plasmassa olevista proteiineista sekä kalvoon sitoutuneista proteiineista, jotka yhdessä täydentävät vasta-ainepohjaista immuunijärjestelmää. Komplementtijärjestelmä on itseään jatkuva kaskadijärjestelmä, joka aktivoituu eri reittejä pitkin. Se toimii opsonisoinnilla, jossa komplementtiproteiinit sitoutuvat mikro-organismeihin aktivoidakseen ja kohdentaakseen granulosyyttejä, monosyyttejä ja makrofageja. Komplementtijärjestelmä aiheuttaa myös mikro-organismien sytolyysin MAC:n (membraanihyökkäyskompleksin) kautta aktivoimalla syöttösoluja. Se myös inaktivoi ja eliminoi palaneet immuunikompleksit sekä suorittaa apoptoottista kunnostusta.

Äskettäinen Neuromyelitis Optica -pilottitutkimus on osoittanut, kuinka komplementtijärjestelmällä on keskeinen osa sellaisen sairauden patogeneesissä, jota aiemmin pidettiin väärin disseminoidun skleroosin varhaisvaiheena. Nämä löydökset johtivat lääkehoitoon antikomplementilla (equlizumab) lupaavilla tuloksilla (8). On mahdollista, että samanlaiset patogeneettiset mekanismit voivat olla ALS:n molekyyliperustana.

Eri tutkimusryhmät ovat yrittäneet selvittää, kuinka immuunijärjestelmä on osallisena ALS:n etenemisessä (9-35). Useat tutkimukset tukevat hypoteesia, että komplementtijärjestelmä on ratkaisevan tärkeä ALS:n alkamiselle ja etenemiselle. (9-28)

Useissa ALS-plasmalla tehdyissä kliinisissä tutkimuksissa on päätelty, että ALS-plasma on sytotoksinen, kun sitä inkuboidaan terveiden punasolujen tai terveen hermokudoksen kanssa. Jotkut tutkimukset osoittavat, että sytotoksisuus johtuu komplementtijärjestelmästä. Tuloksia ei kuitenkaan voida toistaa näin kaikissa kliinisissä kokeissa. Nämä kokeet suoritettiin vuosikymmeniä sitten, jolloin menetelmät komplementin aktiivisuuden havaitsemiseksi olivat rajalliset. (9-14)

Useat eläinkokeet osoittavat, että ALS alkaa neuromuskulaarisista liitoksista (NMJ) ja siksi sitä tulisi pitää distaalisena aksonopatiana eikä keskushermoston sairaudena, mikä nykyään on yleinen käsitys ALS:stä. (27-31)

Hankkeen tarkoitus Tavoitteena on lisätä tietämystä ALS-taudin patofysiologiasta, koska se saattaa johtaa meidät lähemmäksi kohdennettua lääkehoitoa.

Projektiryhmä haluaa selvittää, voidaanko ALS-plasmasta löytää aiemmin löydetty ainutlaatuinen sytotoksisuus (9-14). Jos näin on, nykyaikaiset menetelmät tekevät mahdolliseksi havaita, aiheuttaako immuunijärjestelmä yleensä ja erityisesti komplementtijärjestelmä tämän sytotoksisuuden.

Kansallisen ALS- ja komplementtijärjestelmän tutkimusprojektin perustaminen tekemällä tutkimusbiopankki, jossa kerätään systemaattisesti verta ja selkäydinnestettä ALS-potilailta eri puolilta maata, varmistaa mahdollisuuden selvittää, onko komplementtijärjestelmällä roolia taudin puhkeamisessa. ja ALS:n eteneminen.

Lisäksi suoritetaan pilottitutkimus, jonka tarkoituksena on tutkia, onko ALS-potilailla NMJ:ssä komplementtiaktiivisuutta, kuten ALS-hiirillä tehdyssä tutkimuksessa on osoitettu. (28)

Hypoteesit

1. ALS:lle on ominaista epänormaali immuunivaste, johon liittyy sytotoksisuutta ja lisääntynyt komplementtiaktiivisuus plasmassa, mikä ilmenee seuraavista:

   1. ALS-potilaiden plasmassa on lisääntynyt hemolyyttinen aktiivisuus, kun sitä inkuboidaan terveiden koehenkilöiden punasolujen kanssa.
   2. Komplementin aktiivisuus lisääntyy ALS-potilaiden plasmassa verrattuna neurologisesti terveiden koehenkilöiden ja muiden neurologisten sairauksien potilaiden plasmaan.
   3. ALS-potilaiden plasman hemolyyttinen aktiivisuus korreloi komplementin aktiivisuuden kanssa.
2. ALS-potilaiden selkäydinneste sisältää lisääntynyttä komplementtiaktiivisuutta verrattuna selkäydinnesteeseen, joka on peräisin neurologisesti terveiltä henkilöiltä ja potilailta, joilla on muita neurologisia sairauksia.

Potilaat, materiaalit ja menetelmät:

Kliininen tutkimus 1 (CT1): Hemolyyttinen aktiivisuus ja komplementtijärjestelmä ALS-plasmassa

Tutkittavien määrä: 25 ALS-potilasta, 25 muuta neurologista sairautta sairastavaa potilasta, 25 tervettä vapaaehtoista

CT1:n kulku: Jokaiselta potilaalta otetaan verinäyte. Punaiset verisolut ja veren nestemäinen osa, plasma, erotetaan. Eri koehenkilöiden punasoluja inkuboidaan toisen koehenkilön plasmassa. Sama koekurssi toistetaan sen jälkeen, kun esillä oleva komplementtijärjestelmä on inaktivoitu sekä lämmöllä että anti-komplementilla.

Kliininen tutkimus 2 (CT2): Tapaus-verrokkitutkimus, jonka tarkoituksena on kartoittaa komplementtijärjestelmä

Tutkittavien määrä: 100 ALS-potilasta, 100 muuta neurologista sairautta sairastavaa potilasta ja 100 neurologisesti tervettä potilasta

CT2:Verinäytteet ja aivo-selkäydinneste valmistetaan ja jäädytetään tutkimusbiopankissa. Sitten näytteet kolmesta ryhmästä analysoidaan ja verrataan keskittyen komplementtijärjestelmään: Komplementin aktivaatiopotentiaali mitataan biologisesta materiaalista. Tehdään sytokiiniprofiili sekä kartoitetaan akuutin faasin reaktantit multipleksimäärityksillä. Lisäksi RNA-ekspressioprofiili tehdään solupelletille, joka on stabiloitu myöhemmin RNA:lla.

Kliininen tutkimus 3 (CT3): ALS-potilaiden komplementtijärjestelmä ajan mittaan - kohorttitutkimus Tutkittavien lukumäärä: 20 ALS-potilasta (alaryhmä CT2:sta)

CT3-kurssi: Joka kuudes kuukausi CT2-kurssi toistetaan. Komplementtijärjestelmän aktiivisuus jokaisessa ALS-potilaassa analysoidaan sairauden edetessä.

Kliininen tutkimus 4 (CT4): Komplementin aktiivisuuden etsiminen ALS-potilaiden NMJ:ssä

Tutkittavien lukumäärä: 10 ALS-potilasta

CT4:n kulku: Lihaskoepalat otetaan ja tuodaan välittömästi osastolle. patologia Rigshospitaletissa. Sitten ohuet kudoskerrokset värjätään lihassäikeiden ja NMJ:n analysoimiseksi sekä komplementin aktiivisuuden havaitsemiseksi.

Tutkimuksen toteuttaminen Hanke koostuu neljästä kliinisestä tutkimuksesta. Koehenkilöiden sisällyttäminen tapahtuu yhdessä ALS-poliklinikan henkilökunnan kanssa sairaaloissa ympäri maata ja kontrolliryhmien koehenkilöt on sisällytetty alla olevan luettelon mukaan.

Sisällyttämissivustot:

ALS-poliklinikka, Neurologian klinikka, Rigshospitalet Glostrup (CT1+2+3+4) Yhteyshenkilö: Ylilääkäri Elisabeth Elmo Neurologinen klinikka, Rigshospitalet Glostrup (neurologinen kontrolliryhmä, CT1+2) Yhteyshenkilö: Professori, Ylilääkäri, dr.med. Rigmor Højland Jensen Neurokirurginen klinikka, Rigshospitalet (neurologinen kontrolliryhmä, CT2) Yhteyshenkilö: Professori, ylilääkäri, dr.med. Marianne Juhler ALS-poliklinikka, neurologinen osasto, Bispebjergin sairaala (CT2) Yhteyshenkilö: Ylilääkäri Merete Karlsborgin ALS-poliklinikka, neurologinen osasto, Roskilden sairaala (CT2 + 3) Yhteyshenkilö: Ylilääkäri Helle Thagesen ALS-poliklinikka, Neurologinen klinikka. Odensen yliopistollinen sairaala (CT2) Yhteyshenkilö: Ylilääkäri, dr.med. Matthias Bode ALS-poliklinikka, neurologinen osasto, Århusin sairaala, Nørrebrogade (kliininen tutkimus 2) Yhteyshenkilö: Chief Physician, ph.d. Anette Torvin Gildhøj yksityinen sairaala, Brøndby (neurologisesti terve kontrolliryhmä, kliininen tutkimus 2) Yhteyshenkilö: Anestesiologi Niels Anker Pedersen

Teholaskelmat CT1: Hemolyyttinen aktiivisuus ja komplementtijärjestelmä ALS-plasmassa Tutkimus Overgaard et al. (18) havaitsivat keskimääräisen eron noin 0,20 (SE 0,052 ALS-ryhmässä, N = 20, SD 0,22) absorbanssissa (415 nm ja 5 tuntia inkubaatiota) ALS-potilaiden ja terveiden bioanalyytikkojen välillä. Kun α=0,05 og beta=0,20 vastaa tehoa 0,80, meidän on sisällytettävä 21 koehenkilöä. Mahdollisina keskeyttäneinä ja teknisesti epäonnistuneina pidetään testejä, jotka tutkijat päättävät sisällyttää kuhunkin ryhmään 25 koehenkilöä. (36)

CT2: Komplementtijärjestelmää kartoittava tapaus-verrokkitutkimus Koehenkilöiden lukumäärä kussakin ryhmässä on tässä tapaus-verrokkitutkimuksessa laskettu arvolla α=0,05. Tutkijat vertaavat 3 ryhmän komplementin aktivaatiopotentiaalia, joissa kussakin on sama määrä koehenkilöitä. Terveillä koehenkilöillä komplementin aktivaatiopotentiaali on 100 % normaalialueen ollessa 50-150 % ja alhaisen komplementin aktivaatiopotentiaalin esiintyvyys (alle 50 %) on alle 10 %. Teholla = 0,80 lasketaan tarpeelliseksi sisällyttää kuhunkin ryhmään 100 koehenkilöä. Täten on mahdollista löytää tilastollisesti merkitseviä eroja ryhmien välillä, jotka vastaavat todennäköisyyssuhdetta 2,3, mikä vastaisi 20 % ALS-potilaista, joilla on lisääntyneen komplementin aktiivisuuden aiheuttama alhainen komplementtiaktivaatiopotentiaali. (36)

CT3: ALS-potilaiden komplementtijärjestelmä ajan myötä - kohorttitutkimus Tämä on hypoteesia luova tutkimus. Tähän kohorttiin kuuluvien 20 ALS-potilasta odotetaan olevan alajoukko kliinisestä tutkimuksesta 2. Kontrolliryhmänä lähtötilanteessa käytetään neurologisesti tervettä kontrolliryhmää kliinisestä tutkimuksesta 2.

CT4: Komplementtiaktiivisuuden etsiminen ALS-potilaiden NMJ:ssä Ei ole olemassa aikaisempia tutkimuksia, jotka kuvaavat komplementtiaktiivisuutta NMJ:ssä elävillä ihmisillä. Siksi tehon laskeminen ei ole tarkoituksenmukaista.

Tietojen käsittely CT1: Hemolyyttinen aktiivisuus ja komplementtijärjestelmä ALS-plasmassa. Vertaamalla hemolyysin astetta ALS-potilaiden ja kontrolliryhmien välillä käytetään t-testiä ja yksisuuntaista ANOVAa. Raja-arvojen laskemiseen tutkijat käyttävät vastaanottimen toimintaominaisuuksien (ROC) käyriä.

CT2: Tapaus-verrokkitutkimus, jossa kartoitetaan komplementtijärjestelmä. Komplementin pitoisuuden ja komplementin aktivaatiopotentiaalin vertaaminen ALS-potilaiden ja kontrolliryhmien välillä käytetään t-testiä ja yksisuuntaista ANOVAa. Laskeakseen alhaisen komplementin aktivaatiopotentiaalin todennäköisyyden ALS-ryhmässä verrokkiryhmiin verrattuna tutkijat käyttävät logistista regressiota. Raja-arvojen laskemiseen käytetään vastaanottimen toimintaominaisuuksien (ROC) käyriä.

CT3: ALS-potilaiden komplementtijärjestelmä ajan mittaan - kohorttitutkimus Kuten kliinisessä tutkimuksessa 2. Lisäksi komplementtiaktiivisuuden regressioanalyysi ALS:n alkamisesta kuluneen ajan, sukupuolen, iän, sairauden alatyypin ja taudin etenemisen funktiona ovat suoritettu.

CT4: Komplementtiaktiivisuuden etsiminen ALS-potilaiden NMJ:ssä Kuten CT2:ssa. Komplementin kerrostumisen aste ja lihaspatologia kuvataan kvalitatiivisesti ja sokkopisteytys suoritetaan "normaalin", "kevyen asteen" ja "vakavan asteen" muutoksissa. Tätä verrataan kvantitatiivisesti 2 x K -taulukoihin ja ei-parametrisiin tilastoihin.

Tulosten levittäminen Hankkeen tulokset julkaistaan ​​kansainvälisissä vertaisarvioiduissa julkaisuissa. Sekä positiiviset että negatiiviset tulokset julkaistaan.

Näkökulma Suuren kansallisen ALS-tutkimusbiopankin perustamisen myötä on mahdollista toteuttaa monia tulevia tutkimusprojekteja. Jatkuva ALS-tutkimus on ensiarvoisen tärkeää ALS-potilaille kansallisesti ja kansainvälisesti, jotta voidaan säilyttää toivo tehokkaan lääkehoidon löytämisestä tähän aggressiiviseen sairauteen tulevaisuudessa.