Amyotrofisk lateral sklerose og det medfødte immunsystem

Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er en progressiv, dødelig, neurodegenerativ sygdom, som påvirker de øvre og nedre motoriske neuroner. Dette fører til dybtgående muskeldystrofi, hyperrefleksi, fascikulationer og pareser af bulbaren samt skeletmuskulaturen. ALS forårsager tiltagende fysisk træthed, og patienterne bliver hurtigt sengeliggende og respiratoriske utilstrækkelige. Diagnosen ALS stilles i henhold til El Escorial revisited. Ofte skal kliniske og neurofysiologiske tests gentages (1-4).

I Danmark er forekomsten af ​​ALS 1-2/100.000 og prævalensen er 4-6/100.000. Den gennemsnitlige overlevelsestid fra diagnosetidspunktet er 3 år, men med stor varians. (5+6)

I dag er patogenesen stadig ukendt, og ingen behandling kan stoppe udviklingen af ​​ALS. Behandling med riluzol ser ud til at forlænge den gennemsnitlige overlevelsestid i 2 eller 3 måneder (7).

Mest sandsynligt kræver en fremtidig medicinsk behandling en bedre forståelse af patogenesen samt patofysiologien af ​​ALS. Denne nuværende undersøgelse sigter mod at gøre det baseret på hypotesen om, at ALS delvist eller fuldstændigt er forårsaget af komplementaktivering.

Komplementsystemet er et komplekst system bestående af proteiner i plasma samt membranbundne proteiner, som tilsammen komplementerer det antistofbaserede immunsystem. Komplementsystemet er et selvforstærkende kaskadesystem, som aktiveres gennem forskellige veje. Det virker ved opsonisering, hvor komplementproteiner binder til mikroorganismer for at aktivere og målrette granulocytter, monocytter og makrofager. Komplementsystemet forårsager også cytolyse af mikroorganismer via MAC (membranangrebskompleks) ved aktivering af mastcellerne. Det inaktiverer og eliminerer også udbrændte immunkomplekser samt udfører apoptotisk renovering.

En nylig pilotundersøgelse af Neuromyelitis Optica har vist, hvordan komplementsystemet spiller en central rolle i patogenesen af ​​en sygdom, der tidligere uretmæssigt blev opfattet som et tidligt stadium af dissemineret sklerose. Disse fund resulterede i medicinsk behandling med antikomplement (equlizumab) med lovende resultater (8). Det er muligt, at lignende patogenetiske mekanismer kunne være det molekylære grundlag for ALS.

Forskellige forskningsgrupper har forsøgt at belyse, hvordan immunsystemet er involveret i udviklingen af ​​ALS (9-35). Flere studier understøtter hypotesen om, at komplementsystemet er af afgørende betydning for opståen og progression af ALS. (9-28)

I flere kliniske forsøg med ALS-plasma konkluderes det, at ALS-plasma er cytotoksisk, når det inkuberes med raske røde blodlegemer eller sundt nervevæv. Nogle undersøgelser indikerer, at cytotoksiciteten er forårsaget af komplementsystemet. Resultaterne kan dog ikke reproduceres i alle kliniske forsøg. Disse forsøg blev udført for årtier siden, hvor metoderne til påvisning af komplementaktivitet var begrænsede. (9-14)

Adskillige dyreforsøg indikerer, at ALS starter i de neuromuskulære junctions (NMJ) og derfor bør betragtes som en distal axonopati frem for en central neurologisk sygdom, som i dag er den generelle opfattelse af ALS. (27-31)

Formålet med projektet Formålet er at øge kendskabet til patofysiologien af ​​sygdommen ALS, da dette muligvis kan føre os tættere på en målrettet medicinsk behandling.

Projektgruppen ønsker at undersøge, om en tidligere fundet, unik cytotoksicitet i ALS-plasmaet kan genfindes (9-14). Hvis dette er tilfældet, så gør de moderne metoder i dag det muligt at opdage, om immunsystemet generelt, og i særdeleshed komplementsystemet, forårsager denne cytotoksicitet.

Etableringen af ​​et nationalt forskningsprojekt om ALS og komplementsystemet ved at lave en forskningsbiobank med systematisk opsamlet blod og spinalvæske fra ALS-patienter fra hele landet skal sikre muligheden for at finde ud af, om komplementsystemet spiller en rolle for opståen. og progression af ALS.

Endvidere vil der blive gennemført et pilotstudie med det formål at undersøge, om der er komplementaktivitet i NMJ hos patienter med ALS, som det er blevet vist i et studie med ALS-mus. (28)

Hypoteserne

1. ALS er karakteriseret ved et unormalt immunrespons med cytotoksicitet og øget komplementaktivitet i plasma, som afsløres af følgende:

   1. Plasma fra patienter med ALS viser øget hæmolytisk aktivitet, når det inkuberes med røde blodlegemer fra raske forsøgspersoner.
   2. Komplementaktiviteten er øget i plasma fra ALS-patienter sammenlignet med plasma fra neurologisk raske forsøgspersoner og forsøgspersoner med anden neurologisk sygdom.
   3. Den hæmolytiske aktivitet i plasma fra ALS-patienter er korreleret med komplementaktiviteten.
2. Spinalvæske fra ALS-patienter indeholder øget komplementaktivitet sammenlignet med spinalvæske fra neurologisk raske forsøgspersoner og fra forsøgspersoner med anden neurologisk sygdom.

Patienter, materialer og metoder:

Klinisk forsøg 1(CT1): Hæmolytisk aktivitet og komplementsystemet i ALS-plasma

Antal forsøgspersoner: 25 patienter med ALS, 25 patienter med anden neurologisk sygdom, 25 raske frivillige

Forløbet af CT1: Der udtages en blodprøve fra hver patient. De røde blodlegemer og den flydende del af blodet, plasmaet, adskilles. De røde blodlegemer fra forskellige forsøgspersoner inkuberes i et andet individs plasma. Det samme forsøgsforløb gentages efter inaktivering af det foreliggende komplementsystem både ved varme og ved anti-komplement.

Klinisk forsøg 2(CT2): Case-kontrolstudie med det formål at kortlægge komplementsystemet

Antal forsøgspersoner: 100 patienter med ALS, 100 patienter med anden neurologisk sygdom og 100 neurologisk raske patienter

Forløbet af CT2: Blodprøver og cerebrospinalvæske forberedes og fryses derefter i en forskningsbiobank. Derefter analyseres og sammenlignes prøverne fra de 3 grupper af forsøgspersoner med fokus på komplementsystemet: Komplementaktiveringspotentialet måles i det biologiske materiale. Der laves en cytokinprofil samt kortlægning af akutfasereaktanterne ved multipleksassays. Endvidere er RNA-ekspressionsprofilen lavet på en cellepellet stabiliseret med RNA senere.

Klinisk forsøg 3(CT3): ALS-patienters komplementsystem over tid - et kohortestudie Antal forsøgspersoner:20 patienter med ALS (undersæt fra CT2)

Forløbet af CT3: Hver sjette måned gentages forløbet fra CT2. Aktiviteten af ​​komplementsystemet hos hver patient med ALS analyseres efterhånden som sygdommen skrider frem.

Klinisk forsøg 4(CT4): Søgning efter komplementaktivitet i NMJ af ALS-patienter

Antal forsøgspersoner: 10 patienter med ALS

Forløbet af CT4: Muskelbiopsierne tages og bringes straks til Afd. i patologi på Rigshospitalet. Derefter farves tynde lag af væv for at analysere muskelfibrene og NMJ samt påvise tilstedeværelsen af ​​komplementaktivitet.

Udførelse af undersøgelsen Projektet består af fire kliniske forsøg. Inklusion af forsøgspersonerne sker sammen med personale i ALS-ambulatorier på sygehuse over hele landet og forsøgspersoner til kontrolgrupperne er inkluderet i henhold til nedenstående liste over inklusionssteder.

Inkluderingssteder:

ALS ambulatorium, Neurologisk klinik, Rigshospitalet Glostrup (CT1+2+3+4) Kontakt: Overlæge Elisabeth Elmo Neurologisk Klinik, Rigshospitalet Glostrup (neurologisk kontrolgruppe, CT1+2) Kontakt: Professor, overlæge, dr.med. Rigmor Højland Jensen Neurokirurgisk Klinik, Rigshospitalet (neurologisk kontrolgruppe, CT2) Kontakt: Professor, overlæge, dr.med. Marianne Juhler ALS-ambulatorium, Neurologisk Afd., Bispebjerg Hospital (CT2) Kontakt: Overlæge Merete Karlsborg ALS-ambulatorium, Neurologisk Afd., Roskilde Sygehus (CT2 + 3) Kontakt: Overlæge Helle Thagesen ALS-ambulatorium, Neurologisk Afd. Odense Universitetshospital (CT2) Kontakt: Overlæge, dr.med. Matthias Bode ALS ambulatorium, Neurologisk Afd., Århus Sygehus, Nørrebrogade (Klinisk Forsøg 2) Kontakt: Overlæge, ph.d. Anette Torvin Gildhøj Privathospital, Brøndby (Neurologisk rask kontrolgruppe, Klinisk Forsøg 2) Kontakt: Anæstesilæge Niels Anker Pedersen

Effektberegninger CT1: Hæmolytisk aktivitet og komplementsystemet i ALS-plasma Studiet Overgaard et al. (18) fandt en gennemsnitlig forskel på ca. 0,20 (SE 0,052 i ALS-gruppen, N=20, SD 0,22) i absorbansen (415 nm og 5 timers inkubation) mellem ALS-patienter og raske bioanalytikere. Med α=0,05 og beta=0,20 svarende til potens 0,80 skal vi inkludere 21 emner. Som mulige drop-outs og teknisk mislykkede betragtes prøver, som efterforskerne vælger at inkludere 25 forsøgspersoner i hver gruppe. (36)

CT2: Case-kontrolstudie kortlægning af komplementsystemet Antallet af forsøgspersoner i hver gruppe er i dette case-kontrolstudie beregnet med α=0,05. Forskerne sammenligner komplementaktiveringspotentialet for 3 grupper med samme antal forsøgspersoner i hver. Hos raske forsøgspersoner er komplementaktiveringspotentialet 100 % med et normalt areal på 50-150 %, og hvor prævalensen af ​​lavt komplementaktiveringspotentiale (under 50 %) er under 10 %. Med power =0,80 er det beregnet at være nødvendigt at inkludere 100 forsøgspersoner i hver gruppe. Herved er det muligt at finde statistisk signifikante forskelle mellem grupperne svarende til et oddsratio på 2,3, hvilket ville svare til, at 20 % af ALS-patienter har et lavt komplementaktiveringspotentiale forårsaget af øget komplementaktivitet. (36)

CT3: ALS-patienters komplementsystem over tid - et kohortestudie Dette er et hypotesegenererende studie. Det forventes, at de inkluderede 20 ALS-patienter i denne kohorte vil være en undergruppe fra Clinical Trial 2. Som kontrolgruppe ved baseline vil den neurologisk raske kontrolgruppe fra Clinical Trial 2 blive brugt.

CT4: Søgning efter komplementaktivitet i NMJ hos ALS-patienter Der er ingen tidligere undersøgelser, der beskriver komplementaktiviteten i NMJ hos levende mennesker. Det er derfor ikke relevant at lave en effektberegning.

Databehandling CT1: Hæmolytisk aktivitet og komplementsystemet i ALS-plasma Sammenligning af hæmolysegraden mellem ALS-patienterne og kontrolgrupperne anvendes t-test og envejs ANOVA. Til beregning af afskæringsværdierne bruger efterforskerne modtagerdriftskarakteristik (ROC) kurver.

CT2: Case-kontrol studie kortlægning af komplementsystemet Sammenligning af koncentrationen af ​​komplement og komplementaktiveringspotentialet mellem ALS-patienter og kontrolgruppernes t-test og envejs ANOVA anvendes. For at beregne oddsene for lavt komplementaktiveringspotentiale i ALS-gruppen sammenlignet med kontrolgrupperne bruger efterforskerne logistisk regression. Til beregning af afskæringsværdierne anvendes modtagerdriftskarakteristik (ROC) kurver.

CT3: ALS-patienters komplementsystem over tid - et kohortestudie Som i Clinical Trial 2. Endvidere er regressionsanalyse af komplementaktiviteten som funktion af tid siden opståen af ​​ALS, køn, alder, undertype af sygdom og sygdomsprogression. gennemført.

CT4: Søgning efter komplementaktivitet i NMJ af ALS-patienter Som i CT2. Graden af ​​komplementaflejring og muskelpatologi beskrives kvalitativt, og der udføres en blind scoring i "normal", "let grad" og "alvorlig grad" af ændringer. Dette vil blive sammenlignet kvantitativt med 2 x K-tabeller og ikke-parametrisk statistik.

Formidling af resultater Projektets resultater vil blive publiceret i internationale peer reviewede tidsskrifter. Både positive og negative resultater vil blive offentliggjort.

Perspektivering Med etableringen af ​​en stor national ALS forskningsbiobank vil det være muligt at gennemføre mange fremtidige forskningsprojekter. Kontinuerlig forskning i ALS er altafgørende for ALS-patienter nationalt såvel som internationalt for at bevare håbet om en effektiv medicinsk behandling for denne aggressive sygdom, der findes i fremtiden.