Sclerosi laterale amiotrofica e sistema immunitario innato

La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa progressiva, mortale, che colpisce i motoneuroni superiori e inferiori. Questo porta a distrofia muscolare profonda, iperreflessia, fascicolazioni e paresi della muscolatura bulbare e scheletrica. La SLA provoca un crescente affaticamento fisico ei pazienti diventano presto costretti a letto e respiratori insufficienti. La diagnosi di SLA viene fatta secondo El Escorial rivisitato. Spesso i test clinici e neurofisiologici devono essere ripetuti (1-4).

In Danimarca l'incidenza della SLA è di 1-2/100.000 e la prevalenza è di 4-6/100.000. Il tempo medio di sopravvivenza dal momento della diagnosi è di 3 anni ma con grande varianza. (5+6)

Oggi la patogenesi è ancora sconosciuta e nessun trattamento può arrestare la progressione della SLA. Il trattamento con riluzolo sembra prolungare il tempo mediano di sopravvivenza di 2 o 3 mesi (7).

Molto probabilmente, un futuro trattamento medico richiede una migliore comprensione della patogenesi e della fisiopatologia della SLA. Questo studio mira a farlo sulla base dell'ipotesi che la SLA sia parzialmente o completamente causata dall'attivazione del complemento.

Il sistema del complemento è un sistema complesso costituito da proteine ​​plasmatiche e proteine ​​legate alla membrana che insieme completano il sistema immunitario basato su anticorpi. Il sistema del complemento è un sistema a cascata che si autoalimenta che si attiva attraverso percorsi diversi. Funziona mediante opsonizzazione in cui le proteine ​​del complemento si legano ai microrganismi per attivare e bersagliare granulociti, monociti e macrofagi. Il sistema del complemento provoca anche la citolisi dei microrganismi tramite MAC (membrane attack complex) mediante l'attivazione dei mastociti. Inoltre, inattiva ed elimina i complessi immunitari esauriti, oltre a eseguire il rinnovamento apoptotico.

Un recente studio pilota sulla Neuromielite Ottica ha mostrato come il sistema del complemento svolga un ruolo centrale nella patogenesi di una malattia che in precedenza era erroneamente percepita come uno stadio iniziale della Sclerosi Disseminata. Questi risultati hanno portato a un trattamento medico con anticomplemento (equlizumab) con risultati promettenti (8). È possibile che meccanismi patogenetici simili possano essere le basi molecolari della SLA.

Diversi gruppi di ricerca hanno cercato di chiarire come il sistema immunitario sia coinvolto nella progressione della SLA (9-35). Diversi studi supportano l'ipotesi che il sistema del complemento sia di cruciale importanza per l'insorgenza e la progressione della SLA. (9-28)

In diversi studi clinici con plasma ALS si è concluso che il plasma ALS è citotossico se incubato con globuli rossi sani o tessuto nervoso sano. Alcune ricerche indicano che la citotossicità è causata dal sistema del complemento. I risultati, tuttavia, non possono essere riprodotti di conseguenza in tutti gli studi clinici. Questi studi sono stati condotti decenni fa in cui i metodi per rilevare l'attività del complemento erano limitati. (9-14)

Diversi studi sugli animali indicano che la SLA inizia nelle giunzioni neuromuscolari (NMJ) e quindi dovrebbe essere considerata un'assonopatia distale piuttosto che una malattia neurologica centrale, che oggi è la percezione generale della SLA. (27-31)

Lo scopo del progetto L'obiettivo è aumentare la conoscenza della fisiopatologia della malattia SLA in quanto ciò potrebbe avvicinarci a un trattamento medico mirato.

Il gruppo del progetto vuole indagare se è possibile recuperare una citotossicità unica precedentemente trovata nel plasma della SLA (9-14). Se questo è il caso, allora i moderni metodi di oggi consentono di rilevare se il sistema immunitario in generale, e in particolare il sistema del complemento, sta causando questa citotossicità.

L'istituzione di un progetto di ricerca nazionale sulla SLA e sul sistema del complemento, attraverso la creazione di una biobanca di ricerca con sangue e liquido spinale raccolti sistematicamente da pazienti affetti da SLA di tutto il paese, garantirà l'opportunità di scoprire se il sistema del complemento svolge un ruolo nell'insorgenza e la progressione della SLA.

Inoltre verrà condotto uno studio pilota con lo scopo di indagare se vi è attività del complemento nel NMJ in pazienti con SLA come è stato dimostrato in uno studio su topi ALS. (28)

Le ipotesi

1. La SLA è caratterizzata da una risposta immunitaria anomala con citotossicità e aumento dell'attività del complemento nel plasma, che viene rivelata da quanto segue:

   1. Il plasma di pazienti affetti da SLA mostra una maggiore attività emolitica se incubato con globuli rossi di soggetti sani.
   2. L'attività del complemento è aumentata nel plasma di pazienti con SLA rispetto al plasma di soggetti neurologicamente sani e soggetti con altre malattie neurologiche.
   3. L'attività emolitica nel plasma dei pazienti affetti da SLA è correlata con l'attività del complemento.
2. Il liquido spinale di pazienti affetti da SLA contiene una maggiore attività del complemento rispetto al liquido spinale di soggetti neurologicamente sani e di soggetti con altre malattie neurologiche.

Pazienti, materiali e metodi:

Sperimentazione clinica 1(CT1): Attività emolitica e sistema del complemento nel plasma della SLA

Numero di soggetti: 25 pazienti con SLA, 25 pazienti con altre malattie neurologiche, 25 volontari sani

Il corso di CT1: un campione di sangue viene prelevato da ciascun paziente. I globuli rossi e la parte liquida del sangue, il plasma, vengono separati. I globuli rossi di soggetti diversi vengono incubati nel plasma di un altro soggetto. Lo stesso ciclo di prova viene ripetuto dopo l'inattivazione del presente sistema del complemento sia mediante calore che mediante anti-complemento.

Sperimentazione clinica 2 (CT2): studio caso-controllo volto a mappare il sistema del complemento

Numero di soggetti: 100 pazienti con SLA, 100 pazienti con altre malattie neurologiche e 100 pazienti neurologicamente sani

Il corso di CT2: i campioni di sangue e liquido cerebrospinale vengono preparati e poi congelati in una biobanca di ricerca. Quindi i campioni dei 3 gruppi di soggetti vengono analizzati e confrontati concentrandosi sul sistema del complemento: il potenziale di attivazione del complemento viene misurato nel materiale biologico. Viene creato un profilo delle citochine e mappato i reagenti della fase acuta mediante analisi multiplex. Inoltre il profilo di espressione dell'RNA viene realizzato su un pellet cellulare successivamente stabilizzato con RNA.

Studio clinico 3 (CT3): Il sistema del complemento dei pazienti con SLA nel tempo - uno studio di coorte Numero di soggetti: 20 pazienti con SLA (sottoinsieme da CT2)

Il corso del CT3: Ogni sesto mese si ripete il corso del CT2. L'attività del sistema del complemento in ciascun paziente affetto da SLA viene analizzata con il progredire della malattia.

Studio clinico 4 (CT4): ricerca dell'attività del complemento nel NMJ dei pazienti affetti da SLA

Numero di soggetti: 10 pazienti con SLA

Il decorso della CT4: Le biopsie muscolari vengono prelevate e portate immediatamente al Dip. di Patologia al Rigshospitalet. Quindi sottili strati di tessuto vengono colorati per analizzare le fibre muscolari e il NMJ e rilevare la presenza di attività del complemento.

Conduzione dello studio Il progetto si compone di quattro sperimentazioni cliniche. L'inclusione dei soggetti viene effettuata insieme al personale delle cliniche ambulatoriali per la SLA negli ospedali di tutto il paese e i soggetti per i gruppi di controllo sono inclusi in base all'elenco dei siti di inclusione di seguito.

Siti di inclusione:

Ambulatorio ALS, Clinica neurologica, Rigshospitalet Glostrup (CT1+2+3+4) Contatto: Primario Clinica neurologica Elisabeth Elmo, Rigshospitalet Glostrup (gruppo di controllo neurologico, CT1+2) Contatto: Professore, Primario, dr.med. Rigmor Højland Jensen Neurosurgical Clinic, Rigshospitalet (gruppo di controllo neurologico, CT2) Contatto: Professore, primario, dr.med. Marianne Juhler Ambulatorio SLA, Reparto Neurologico, Ospedale Bispebjerg (CT2) Contatto: Primario Merete Karlsborg Ambulatorio SLA, Reparto Neurologico, Ospedale Roskilde (CT2 + 3) Contatto: Primario Helle Thagesen Ambulatorio SLA, Reparto Neurologico, Ospedale universitario di Odense (CT2) Contatto: primario, dr.med. Matthias Bode Clinica ambulatoriale ALS, Neurological Dep., Aarhus Hospital, Nørrebrogade (Sperimentazione clinica 2) Contatto: Primario, ph.d. Anette Torvin Gildhøj Private Hospital, Brøndby (gruppo di controllo neurologicamente sano, sperimentazione clinica 2) Contatto: anestesista Niels Anker Pedersen

Calcolo della potenza CT1: Attività emolitica e sistema del complemento nel plasma della SLA Lo studio Overgaard et al. (18) hanno trovato una differenza media di circa 0,20 (SE 0,052 nel gruppo SLA, N=20, SD 0,22) nell'assorbanza (415 nm e 5 ore di incubazione) tra pazienti SLA e bioanalisti sani. Con α=0,05 og beta=0,20 corrispondente alla potenza 0,80 dobbiamo includere 21 soggetti. Poiché sono considerati test possibili abbandoni e tecnicamente falliti, gli investigatori scelgono di includere 25 soggetti in ciascun gruppo. (36)

CT2: Studio caso-controllo che mappa il sistema del complemento Il numero di soggetti in ogni gruppo è in questo studio caso-controllo calcolato con α=0,05 I ricercatori confrontano il potenziale di attivazione del complemento di 3 gruppi con la stessa quantità di soggetti in ciascuno. Nei soggetti sani il potenziale di attivazione del complemento è del 100% con un'area normale che va dal 50 al 150% e dove la prevalenza del potenziale di attivazione del complemento basso (sotto il 50%) è inferiore al 10%. Con potenza =0,80 si calcola che sia necessario includere 100 soggetti in ogni gruppo. In questo modo è possibile trovare differenze statisticamente significative tra i gruppi corrispondenti a un odds ratio di 2,3, che corrisponderebbe al 20% dei pazienti affetti da SLA con un basso potenziale di attivazione del complemento causato dall'aumento dell'attività del complemento. (36)

CT3: Il sistema del complemento dei pazienti con SLA nel tempo - uno studio di coorte Questo è uno studio che genera ipotesi. Si prevede che i 20 pazienti affetti da SLA inclusi in questa coorte saranno un sottogruppo della sperimentazione clinica 2. Come gruppo di controllo al basale verrà utilizzato il gruppo di controllo neurologicamente sano della sperimentazione clinica 2.

CT4: Ricerca dell'attività del complemento nel NMJ dei pazienti con SLA Non ci sono studi precedenti che descrivano l'attività del complemento nel NMJ negli esseri umani viventi. Non è quindi rilevante fare un calcolo della potenza.

Elaborazione dati CT1: Attività emolitica e sistema del complemento nel plasma SLA Confronto del grado di emolisi tra i pazienti SLA ei gruppi di controllo Vengono utilizzati il ​​t-test e l'ANOVA ad una via. Per calcolare i valori di cut-off, i ricercatori utilizzano le curve delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC).

CT2: Studio caso-controllo che mappa il sistema del complemento Confrontando la concentrazione del complemento e il potenziale di attivazione del complemento tra i pazienti affetti da SLA ei gruppi di controllo vengono utilizzati il ​​test t e l'ANOVA unidirezionale. Per calcolare le probabilità di un basso potenziale di attivazione del complemento nel gruppo ALS rispetto ai gruppi di controllo, i ricercatori utilizzano la regressione logistica. Per il calcolo dei valori di cut-off vengono utilizzate le curve delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC).

CT3: Il sistema del complemento dei pazienti affetti da SLA nel tempo - uno studio di coorte Come nella sperimentazione clinica 2. Inoltre, l'analisi di regressione dell'attività del complemento in funzione del tempo dall'insorgenza della SLA, il sesso, l'età, il sottotipo di malattia e la progressione della malattia sono condotto.

CT4: Ricerca dell'attività del complemento nel NMJ dei pazienti affetti da SLA Come in CT2. Il grado di deposizione del complemento e la patologia muscolare sono descritti qualitativamente e viene condotto un punteggio cieco in "normale", "grado lieve" e "grado grave" dei cambiamenti. Questo sarà confrontato quantitativamente con tabelle 2 x K e statistiche non parametriche.

Disseminazione dei risultati I risultati del progetto saranno pubblicati su riviste internazionali peer reviewed. Sia i risultati positivi che quelli negativi saranno pubblicati.

Prospettive Con l'istituzione di una grande biobanca nazionale per la ricerca sulla SLA sarà possibile condurre molti futuri progetti di ricerca. La continua ricerca sulla SLA è fondamentale per i pazienti affetti da SLA a livello nazionale e internazionale al fine di mantenere la speranza che in futuro si trovi un trattamento medico efficiente per questa malattia aggressiva.